背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測唾液中的安非他明

郭 暢，周 浩，許 芳，李新霞，李久彤，，李建光*

(1.新疆醫科大學藥學院，新疆 烏魯木齊 830011；2.上海鑫譜生物科技有限公司，上海 201318)

安非他明(Amphetamine,AMP)即苯丙胺，又稱苯基乙丙胺、α-甲基苯乙胺，分子式為C9H13N，游離態AMP為無色或淡黃色揮發性油狀物，味酸苦且帶有胺臭，常見制劑為其硫酸鹽或磷酸鹽[1]。AMP類藥物最初用于治療嗜睡癥、帕金森氏綜合征、早發性癡呆和器質性精神病等，但由于其對機體造成的不可逆損傷，如興奮毒性、氧化應激和代謝紊亂等，而被列為毒品[2-3]。《2019年世界毒品報告》[4]顯示，全世界大約有2 900萬人正在使用AMP類藥物，其中，歐洲約有290萬人使用過AMP。2018年，歐洲廢水分析結果顯示，AMP的人均使用量是冰毒的2.6倍。

目前，檢測AMP類藥物主要采用氣相色譜法(GC)[5]、高效液相色譜法(HPLC)[6]、氣相色譜-質譜聯用法(GC-MS)[7]、超高效液相色譜-串聯質譜聯用法(UPLC-MS/MS)[8]、毛細管電泳法(CE)[9]、酶聯免疫分析法(EIA)[10]和熒光偏振免疫分析法(FPIA)[11]。相較于檢測時程長且消耗大量有機試劑的色譜法，免疫分析法因其高特異性、高靈敏度、快速等優點近年來在毒品濫用監測方面得到廣泛研究。

作者采用膠體金標記技術[12-14]，將單克隆抗體AMP-mAb標記到膠體金上，制備金標探針；再將AMP完全抗原AMP-BSA和羊抗鼠抗體IgG 依次包被到膜面熒光硝酸纖維素(NC)膜的檢測線和控制線上，與金標探針等組裝制備試紙條；結合全自動干式熒光免疫分析儀創建背景熒光猝滅-免疫層析法，對唾液中AMP進行快速定量檢測。

1 實驗

1.1 材料、試劑與儀器

HF 13502S20型硝酸纖維素膜，Millipore公司；SI31-40型聚氯乙烯(PVC)膠板，韓感中國；吸水紙，上海捷寧生物科技有限公司；Fusion 5型樣品墊，Whatman公司；KB50型玻纖,上海良值科技公司。

AMP標準品，Cerilliant公司；AMP抗體和抗原試劑，杭州隆基生物科技公司；小分子封閉劑DB1130，Blockmaster公司；碳酸鉀、檸檬酸鈉、氯化鈉、氯化鉀、硫氰酸鉀(KSCN)、磷酸氫二鉀、尿素(NH2CONH2)、十水硫酸鈉、氯化銨、二水氯化鈣、碳酸氫鈉、氯金酸，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；實驗用水為去離子水。

Simp 4型全自動干式熒光免疫分析儀，上海鑫譜生物科技有限公司；VELOCITY 14R型臺式高速冷凍離心機，上海天美生化儀器設備工程有限公司；BSM-220.4型電子天平，上海卓精電子科技有限公司；MS-H280-Pro型數顯加熱型磁力攪拌器、MX-F型振蕩器，大龍興創實驗儀器有限公司；L6S型紫外可見分光光度計，上海儀電分析儀器有限公司；Tecnai G2S-TWIN型透射電子顯微鏡，美國FEI公司；C6型切條機、T-DOA型臺式點膜噴金一體機，韓感中國。

1.2 人工唾液的配制

取NaCl 0.126 g、KCl 0.964 g、KSCN 0.189 g、KH2PO40.654 g、NH2CONH20.200 g、Na2SO4·10H2O 0.763 g、NH4Cl 0.178 g、CaCl2·2H2O 0.228 g、NaHCO30.630 g，加入去離子水并定容至1 000 mL，用鹽酸調pH值至6.8，混勻，即得人工唾液。

1.3 AMP系列標準溶液的配制

將1 mg·mL-1AMP標準溶液用人工唾液稀釋成濃度(ng·mL-1)分別為0、10、25、50、100、200、400的AMP系列標準溶液。

1.4 膠體金的制備與表征

采用檸檬酸鈉還原法[15]制備膠體金。取198 mL純化水，加入2 mL 1%HAuCl4溶液，混勻后置于磁力攪拌器上加熱至沸騰；然后快速加入5 mL 1%檸檬酸鈉水溶液，繼續加熱至溶液呈酒紅色；持續煮沸20 min后攪拌冷卻至室溫，即得膠體金。

利用紫外可見分光光度計測定膠體金的紫外可見吸收光譜，利用透射電子顯微鏡觀察膠體金粒徑大小。

1.5 金標探針的制備

取1 mL膠體金溶液，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液、5 μg 單克隆抗體AMP-mAb，混勻后加入10 μL 10%的小分子封閉劑DB1130，充分混勻后于4 ℃、12 000 r·min-1離心12 min，棄去上清液，沉淀用純水定容至200 μL，即得金標探針，即金標AMP-mAb 溶液，4 ℃儲存，備用。

1.6 試紙條的制備及結果判讀

試紙條包括PVC膠板、樣品墊、鋪金墊、膜面熒光硝酸纖維素(NC)膜和吸水墊等5部分，其結構如圖1所示。

圖1 試紙條的結構

制備：將NC膜貼到PVC板中間，用臺式點膜噴金一體機先將1 mg·mL-1的AMP完全抗原AMP-BSA和0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗體IgG先后包被在NC膜的檢測線(T線)和控制線(C線)處；再將金標探針包被在玻纖材料上，置于37 ℃烘箱內干燥4 h后取出；將鋪金墊、樣品墊和吸水墊依次貼于NC 膜的兩端，相互重疊1.0 mm；用切條機切割成3.4 mm寬，并與干燥劑一起放入鋁箔袋中，密封，備用。

結果判讀：取待測樣品溶液60 μL，滴加至試紙條的樣品墊上，此時樣品溶液會因毛細作用沿試紙條向前移動。當樣品溶液中沒有目標毒品AMP時(圖1b)，溶液流經鋪金墊后會溶解事先固定好的金標探針，隨后金標探針會和T線上的AMP-BSA結合而顯現膠體金的紫紅色；剩余的探針繼續向前移動，被C 線的二抗捕獲，C線也出現紫紅色條帶；當樣品溶液中含有AMP時(圖1a)，部分金標探針會因優先與樣品溶液中的AMP結合而不停留在T線上，T線顏色將變淺或消失。無論樣品中是否含有AMP，C線都應該出現紫紅色，否則該試紙條結果判定為無效。

1.7 背景熒光猝滅-免疫層析法的構建

在制備了AMP層析試紙條后，結合全自動干式熒光免疫分析儀創建背景熒光猝滅-免疫層析法檢測唾液中的AMP。按1.6方法操作，室溫層析5 min后，將試紙條插入全自動干式熒光免疫分析儀，掃描結束后自行記錄F0(背景熒光強度)和F1(T 線熒光強度)及F0/F1值(T 線的熒光猝滅信號)。

1.8 背景熒光猝滅-免疫層析法的條件優化

1.8.1 試紙條的AMP-BSA最佳包被濃度

在試紙條的T 線上分別包被0.75 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1的AMP-BSA，C線上包被0.5 mg·mL-1的羊抗鼠抗體IgG。按1.6方法操作，測定F0/F1值，篩選AMP-BSA的最佳包被濃度。

1.8.2 金標探針的K2CO3最佳加量

取1 mL膠體金溶液4份，分別加入4 μL、5 μL、6 μL、7 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再向各管加入5 μg AMP-mAb，混勻后加入10 μL 10%的小分子封閉劑 DB1130，充分混勻后于4 ℃、12 000 r·min-1離心12 min，觀察各管顏色。以膠體金全部沉于底部且無膠體金貼壁現象發生時的K2CO3加量為最佳。

1.8.3 金標探針的AMP-mAb最佳加量

取1 mL膠體金溶液3份，加入5 μL 0.1 mol·L-1K2CO3溶液，再分別加入3 μg、5 μg、7 μg的AMP-mAb，按1.6方法操作，測定F0/F1值，篩選AMP-mAb的最佳加量。

1.9 背景熒光猝滅-免疫層析法的性能評價

以人工唾液為建標基質，配制AMP系列標準溶液。按1.6方法操作，采用背景熒光猝滅-免疫層析法測定AMP系列標準溶液的F0/F1值。以AMP濃度(ng·mL-1)為橫坐標、有效試紙條上F0/F1值為縱坐標繪制標準曲線，運用 Origin 8.6軟件進行擬合，得到AMP的擬合方程及相關系數。

對背景熒光猝滅-免疫層析法進行方法學考察，如重復性、檢出限、加標回收率及特異性等，并與UPLC-MS/MS法進行比對，分析兩種方法的相關性和一致性。

2 結果與討論

2.1 膠體金的表征

膠體金的紫外可見吸收光譜與TEM照片如圖2所示。

從圖2可知，膠體金的最大吸收峰位于520 nm處，吸光度為0.9(圖2a)；膠體金顆粒呈規整的圓形，粒徑在22 nm左右(圖2b)。

圖2 膠體金的紫外可見吸收光譜(a)與TEM照片(b)

2.2 背景熒光猝滅-免疫層析法的條件

2.2.1 試紙條的AMP-BSA最佳包被濃度

不同AMP-BSA包被濃度對應F0/F1值與AMP濃度的關系曲線如圖3 所示。

圖3 不同AMP-BSA包被濃度對應F0/F1值與AMP濃度的關系曲線

從圖3可知，當AMP-BSA包被濃度為 0.75 mg·mL-1時，F0/F1值與AMP濃度的變化關系不明顯；當AMP-BSA包被濃度為1.5 mg·mL-1時，陰性和10 ng·mL-1AMP的F0/F1值區別不大；當AMP-BSA包被濃度為1.0 mg·mL-1時，F0/F1值與AMP濃度的變化關系最明顯，且低濃度AMP的F0/F1值差異較AMP-BSA包被濃度為2.0 mg·mL-1時更顯著。因此，確定最佳AMP-BSA包被濃度為1.0 mg·mL-1。

2.2.2 金標探針的K2CO3最佳加量

實驗發現，當K2CO3加量為4 μL時，離心后有部分膠體金貼壁，且棄去上清液后，貼壁膠體金不能完全復溶于純水中；當K2CO3加量為5 μL、6 μL和7 μL時，離心后的膠體金全部均勻沉淀在試管底部，無貼壁現象，且上層溶液干凈、透亮。因此，確定金標探針的K2CO3最佳加量為5 μL。

2.2.3 金標探針的AMP-mAb最佳加量

不同AMP-mAb加量對應F0/F1值與AMP濃度的關系曲線如圖4 所示。

圖4 不同AMP-mAb加量對應F0/F1值與AMP濃度的關系曲線

從圖4可知，當AMP-mAb加量為5 μg時，不同濃度AMP的F0/F1值差異最顯著，且每個濃度點的兩次測量結果相對穩定。因此，AMP-mAb最佳加量為5 μg，即每標記1 mL膠體金溶液加入5 μg AMP-mAb。

2.3 背景熒光猝滅-免疫層析法的性能評價

2.3.1 標準曲線與檢出限

AMP的標準曲線如圖5所示。

圖5 AMP的標準曲線

用Logistic模型(四參數)對標準曲線進行擬合，得到方程y=A2+(A1-A2)/[1+(x/x0)P]，R=0.9993，其中，A1=5.64403，A2=0.95357，x0=36.634，P=1.04805。表明，AMP濃度在0～400 ng·mL-1范圍內與F0/F1值呈良好的相關性。

不同濃度AMP層析試紙條檢測結果如圖6所示。

1～7，AMP濃度(ng·mL-1)：0、10、25、50、100、200、400

2.3.2 重復性

按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法測定10 ng·mL-1和 50 ng·mL-1AMP溶液各10次，F0/F1平均值分別為5.0129±0.0913、3.0485±0.1333，測得濃度分別為(7.28±0.89)ng·mL-1、(46.31±5.16)ng·mL-1，RSD 分別為12.23%、11.14%。表明，背景熒光猝滅-免疫層析法的重復性較好。

2.3.3 檢出限

取空白試樣，按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法連續測定10次，F0/F1平均值為5.910 5，標準差(sd)為0.129 3，計算得到m-2sd，將其代入回歸方程得到對應的濃度值，即為檢出限0.9 ng·mL-1。

2.3.4 加標回收率

取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，分別加入到1 mL濃度為25 ng·mL-1的AMP 溶液中，混勻后記為樣品1和樣品2；取500 ng·mL-1和1 000 ng·mL-1的AMP溶液各100 μL，再分別加入到1 mL濃度為100 ng·mL-1的AMP溶液中，混勻后記為樣品3和樣品4。按1.6方法操作，用背景熒光猝滅-免疫層析法對4個樣品溶液重復測定3次，計算加標回收率，結果見表1。

從表1可知，4 個樣品溶液用背景熒光猝滅-免疫層析法測定的加標回收率在86.66%～99.50%之間，均在85%～115% 之間。表明，用背景熒光猝滅-免疫層析法測定的加標回收率較好。

表1 加標回收率測定結果(n=3)

2.3.5 特異性

分別取 5 mg·mL-1蔗糖，50 ng·mL-1的NaHCO3、薄荷醇和阿司匹林，非目標毒品1 000 ng·mL-1的可卡因、嗎啡、美沙酮和氯胺酮，100 ng·mL-1的可替寧和芬太尼溶液，按1.6方法操作，重復測定3 次，檢測背景熒光猝滅-免疫層析法的特異性。結果發現，10 種藥品和非目標毒品對背景熒光猝滅-免疫層析法的檢測無干擾。

2.3.6 比對實驗

分別采用背景熒光猝滅-免疫層析法與UPLC-MS/MS法同時檢測15例樣本，運用SSPS 22.0軟件對結果進行配對t檢驗。結果顯示：t=0.969，P=0.349>0.05，表明背景熒光猝滅-免疫層析法與UPLC-MS/MS法無統計學差異。

以背景熒光猝滅-免疫層析法檢測結果(x)為橫坐標、UPLC-MS/MS 法檢測結果(y)為縱坐標繪制關系曲線,如圖7所示。

圖7 兩種方法檢測AMP系列標準溶液的直線相關性

對圖7進行擬合，得到一元直線回歸方程y=0.91x+9.24，R=0.995>0.9，表明兩種方法相關性良好。

2.4 討論

近年來，免疫分析法在毒品濫用監測、食品檢測[16]及疾病體外診斷[17]等方面得到廣泛研究。張喜芳[18]研制的膠體金檢測試劑能對尿液中的AMP進行定性檢測。相比較而言，背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測AMP靈敏度高、專屬性強、檢測范圍較廣，檢測結果準確且重復性好，檢測過程所需樣本量少，所用試劑安全、無毒且環保，可在5 min內快速準確檢測唾液中的AMP，打破了傳統免疫層析試紙條只能對生物樣本中的濫用藥物進行定性檢測的局限，有望成為法庭供述的依據。

3 結論

創建了背景熒光猝滅-免疫層析法定量檢測唾液中的AMP。AMP濃度在0～400 ng·mL-1范圍內與熒光猝滅信號呈良好的相關性，檢出限為0.9 ng·mL-1，加標回收率為86.66%～99.50%，重復性RSD<13%，10 種常見毒品和藥品均對檢測結果無干擾，與UPLC-MS/MS法檢測結果相關性良好。背景熒光猝滅-免疫層析法可以快速定量檢測唾液中的 AMP，具有良好的相關性、精密度和準確性，操作簡便，成本低且儀器便于攜帶，適于快速現場檢測和基層推廣。