杉木ClKptA/Tpt1基因的克隆及其表達(dá)特性分析

楊世全 彭丹 費(fèi)文杰 楊豐 屈高毅 唐威威 歐劍萍 鄧湘雯 周波

（中南林業(yè)科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)沙 410004）

杉木人工林已成為亞熱帶森林的重要組成部分，它具有可持續(xù)的自然更新能力，是決定杉木林群落演替方向和維持杉木林大面積存在的基礎(chǔ)［1］，杉木是我國(guó)南方重要的速生用材樹種，廣泛分布于我國(guó)17個(gè)省份［2］。由于杉木樹干通直，不翹不裂，材質(zhì)優(yōu)良，是房屋建造和制作家具的上等木材。全國(guó)第八次森林資源清查結(jié)果表明，杉木林面積達(dá)1.096×107hm2，木材蓄積量為 7.260×108m3，分別占喬木林總面積和木材總蓄積量的 6.66%和4.91%［2］。杉木木材用量占我國(guó)木材總用量的 1/3左右［3-4］。

在我國(guó)杉木種植廣泛的地區(qū)，也是土壤中營(yíng)養(yǎng)元素缺乏的地方，尤其是有效磷的含量。目前缺磷的現(xiàn)狀嚴(yán)重的已經(jīng)嚴(yán)重影響了植物的生長(zhǎng)發(fā)育［5］，植物缺乏磷時(shí)，導(dǎo)致植物葉綠素減少，植物變得矮小等。除此之外，磷元素也是影響木質(zhì)素生物合成的因素，王艷麗等［6］發(fā)現(xiàn)，煙草木質(zhì)素的含量和磷濃度顯著性相關(guān)，磷濃度越高木質(zhì)素含量越高，說明磷影響了煙草纖維素和木質(zhì)素含量的比例。于琳等［7］發(fā)現(xiàn)磷肥能夠使得亞麻莖桿增粗，促進(jìn)纖維素細(xì)胞數(shù)量增加，有利于纖維素束的形成。在木本植物研究方面，磷元素與木質(zhì)素生物合成的關(guān)系還比較少，Thomas等［8］研究發(fā)現(xiàn)，桉樹在磷元素缺乏的情況下，其木質(zhì)素的生物合成受到嚴(yán)重了抑制。但是磷影響木質(zhì)素生物合成的分子機(jī)制在很大程度上仍不清楚。

KptA/Tpt1是一類磷酸轉(zhuǎn)移酶［9］，是催化ADP-核糖基化ART超級(jí)家族中的H-H-h家族的成員［10］，通常存在于編碼該家族的生物體的單一個(gè)體中，KptA/Tpt1在真核細(xì)胞中有很強(qiáng)的保守序列，在細(xì)菌群中KptA/Tpt1可以修飾RNA以外的底物［11］。研究發(fā)現(xiàn)，在真核生物tRNA剪接過程中，KptA/Tpt1將tRNA 2'-磷酸轉(zhuǎn)移到NAD+上［12］，釋放出成熟的tRNA和形成ADP-核糖1'-2'環(huán)磷酸（Appr＞p）［13］。然而，KptA/Tpt1蛋白的功能具有生物差異性，因此不同生物的KptA/Tpt1蛋白調(diào)控的網(wǎng)絡(luò)機(jī)制需要進(jìn)一步的挖掘。在杉木中，磷酸轉(zhuǎn)移酶KptA/Tpt1是否能調(diào)控木質(zhì)素的合成尚未明晰，因此本論文克隆了杉木磷酸轉(zhuǎn)移酶ClKptA/Tpt1基因，解析杉木ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)是否受磷調(diào)控，進(jìn)而影響木質(zhì)素的生物合成，為杉木育種以及合理施肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

一年生的杉木莖材料采自實(shí)驗(yàn)室盆栽的杉木，大腸桿菌DH5α和BL21 star（DE3），原核表達(dá)載體pCold-TF均為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶和T4DNA連接酶均購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA的提取及其逆轉(zhuǎn)錄 用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取了杉木莖的總RNA，然后用（TaKaRa）公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.2.2ClKptA/Tpt1基因克隆 根據(jù)杉木轉(zhuǎn)錄組測(cè)得的序列，采用 Primer 5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)出擴(kuò)增磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ClKptA/Tpt1的全長(zhǎng)CDS的引物序列，并在5'端和3'帶上BamH I和Hind III兩種酶的酶切位點(diǎn)。以上述逆轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果。PCR反應(yīng)體系為：10×PCR buffer 2 μL，ddH2O 14 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物各0.5 μL，rTaq 聚合酶0.5 μL，cDNA 0.5 μL，總體積20 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃ 30 s，66℃ 30 s，72℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min，4℃ 保存。

1.2.3 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ClKptA/Tpt1生物信息學(xué)分析 在NCBI中下載已報(bào)道物種KptA/Tpt1的氨基酸序列，應(yīng)用MEGA5.0軟件構(gòu)建了ClKptA/Tpt1與已報(bào)道物種KptA/Tpt1的系統(tǒng)進(jìn)化樹。用GENEDOC軟件對(duì)已報(bào)道物種KptA/Tpt1和ClKptA/Tpt1的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析。用TMHMM Server v.2.0在線分析軟件分析了ClKptA/Tpt1的跨膜結(jié)構(gòu)。用SWISSMODEL工具預(yù)測(cè)了ClKptA/Tpt1蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.4 表達(dá)載體的構(gòu)建 PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后用BamH I和Hind III兩種酶進(jìn)行雙酶切，同時(shí)將pCold-TF載體用BamH I和Hind III兩種酶進(jìn)行雙酶切，酶切后用天根生物技術(shù)有限公司（TIANGEN）的回收試劑盒純化，將純化得到的pCold載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物通過熱激轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)中，在轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物中加入LB液體培養(yǎng)基在37℃震蕩培養(yǎng)箱中170 r/min搖45 min，6 000 r/min離心1 min后，倒掉上清液，取200 μL涂在含100 μg/mL氨芐固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過夜。

1.2.5 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ClKptA/Tpt1原核表達(dá)工程菌的獲得 挑出陽(yáng)性克隆菌斑，接種于含有100 μg/mL的氨芐液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過夜，用天根（TIANGEN）質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到宿主菌BL21 star（DE3）中，涂布于含有100 μg/mL氨芐青霉素LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置過夜培養(yǎng)，隨機(jī)挑選單菌落，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

1.2.6 目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 將陽(yáng)性工程菌在含有（100 μg/mL）的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)，加入終濃度為0.1 mol/L ITPG，在15℃誘導(dǎo)24 h，超聲處理后取上清液進(jìn)行SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)情況。

IPTG濃度的優(yōu)化 選定誘導(dǎo)時(shí)間為24 h，溫度為15℃。加入使終濃度分別為0、0.4、0.6、0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE電泳鑒定表達(dá)情況。

1.2.7 磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ClKptA/Tpt1表達(dá)模式研究 用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒分別提取一年生杉木根、莖、葉、花、果的總RNA，然后用TaKaRa公司的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以上述不同的cDNA為模板做RT-PCR，反應(yīng)體系為：SYBR premis E×Taq（2%）5 μL，上下游引物各0.2 μL，cDNA 0.8 μL，ddH2O 3.8 μL，總體積為10 μL。反應(yīng)程序：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min；95℃ 15 s。

分別以不同濃度的磷處理一年生杉木苗，處理濃度分別為：0.067 mmol/L、0.133 mmol/L、0.20 mmol/L，處理時(shí)間間隔為60 d，提取不同濃度磷處理后的杉木RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA做RT-qPCR，反應(yīng)體系同上。

1.2.8 木質(zhì)素的提取 用Klason法測(cè)木質(zhì)素含量，切取一年生杉木的下面主莖，烘干后研磨成均勻粉末，過篩（40-60 μm）。甲醇提取后，烘干，取約200 mg樣品，用72% H2SO430℃抽提1 h，加入112 mL H2O沸煮1 h，注意保持總體積恒定，該混合液經(jīng)（40-60 μm）篩過濾，并用500 mL熱水沖洗，烘干后稱重。木質(zhì)素含量以最后獲得木質(zhì)素占原始樣品重量的百分?jǐn)?shù)計(jì)算［14］。

2 結(jié)果

2.1 ClKptA/Tpt1的克隆與生物信息學(xué)分析

提取一年生杉木莖的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。以該cDNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增和電泳檢測(cè)，得到大小1 100 bp左右的特異性條帶（圖1-A），說明克隆得到了目的基因ClKptA/Tpt1。膠回收ClKptA/Tpt1的PCR產(chǎn)物，用BamHI和HindIII酶切ClKptA/Tpt1的PCR產(chǎn)物和pCold-TF載體，采用酶切連接的方式將PCR產(chǎn)物和pCold-TF載體連接成重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）LB固體培養(yǎng)基中37℃過夜培養(yǎng)，對(duì)長(zhǎng)出的菌斑進(jìn)行菌液PCR，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，有1 100 bp左右的目的基因條帶，既為陽(yáng)性克隆菌斑。挑選3個(gè)陽(yáng)性克隆送去上海生工生物工程有限公司測(cè)序。測(cè)序結(jié)果顯示ClKptA/Tpt1的CDS長(zhǎng)1 143 bp。將序列正確的ClKptA/Tpt1用primer primer 5.0翻譯成氨基酸序列，總共編碼380個(gè)氨基酸。用MEGA 5.0軟件構(gòu)建ClKptA/Tpt1和已報(bào)道物種KptA/Tpt1氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹，KptA/Tpt1進(jìn)化樹分析表明，杉木的ClKptA/Tpt1氨基酸親緣性與荷花的KptA/Tpt1相似性最高，而與番茄的KptA/Tpt1相似性最低（圖1-B）。利用GENEDOC軟件對(duì)比ClKptA/Tpt1與已報(bào)道物種KptA/Tpt1 氨基酸序列，研究結(jié)果表明ClKptA/Tpt1的氨基酸序列與其它物種都有相同的保守序列NADAR domain（圖1-C）。蛋白的跨膜區(qū)分析結(jié)果分析得到ClKptA/Tpt1不存在跨膜氨基酸（圖1-D），利用SWISS-MODEL在線軟件對(duì)ClKptA/Tpt1蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ClKptA/Tpt1主要由α鏈和β鏈組成，都含有配體，但是配體的數(shù)量不同（圖1-E）。

2.2 ClKptA/Tpt1/Tpt1的原核表達(dá)

圖1 ClKptA/Tpt1的克隆與生物信息學(xué)分析

將上述測(cè)序結(jié)果與之前已有序列進(jìn)行比對(duì)分析完全相同，說明已經(jīng)成功構(gòu)建了杉木磷酸轉(zhuǎn)移酶ClKptA/Tpt1原核表達(dá)載體，對(duì)測(cè)序正確的菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL 21 star（DE3）菌株的感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB固體培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)過夜，對(duì)長(zhǎng)出的菌斑進(jìn)行菌液PCR，能看到1 100 bp左右的目的條帶（圖2-B），說明重組質(zhì)粒已經(jīng)成功轉(zhuǎn)入了原核表達(dá)菌株BL 21 star（DE3）中。將陽(yáng)性工程菌在含有（100 μg/mL）的氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600值達(dá)到0.6左右時(shí)，加入終濃度分別為0.0、0.4、0.6、0.8 mmol/L ITPG，在15℃誘導(dǎo)24 h，超聲處理后取上清液進(jìn)行SDSPAGE電泳檢測(cè)。結(jié)果顯示，在超聲波破碎后的液體中含有大量的目的蛋白，與pCold-TF空載體相比，在大約100 kD處有大量的蛋白富集（圖2-C），圖2-C中箭頭標(biāo)注的位置就是目的蛋白的富集區(qū)。

2.3 ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)模式研究與分析

用Invitrogen公司的RNA提取試劑盒提取了杉木根、莖、葉、花、果的RNA，RT-qPCR結(jié)果顯示，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達(dá)量最高，其次是果中的表達(dá)量，而在莖中的表達(dá)量最低（圖3）。

圖2 ClKptA/Tpt1的原核表達(dá)

圖3 ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)模式檢測(cè)

2.4 磷調(diào)控了ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)從而影響了杉木木質(zhì)素的合成

分 別 用0.0、0.067、0.133、0.20 mmol/L不 同濃度的磷處理杉木，每組濃度設(shè)計(jì)3組平行組，提取不同磷濃度處理下的杉木葉片RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用RT-qPCR技術(shù)分析磷處理下ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，在0.0-0.20 mmol/L濃度范圍內(nèi)，ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)量隨著磷濃度的增加而增加（圖4-A），說明磷在某種程度上調(diào)控了ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)。通過Klason法測(cè)定木質(zhì)素含量。結(jié)果表明，在0-0.20 mmol/L不同磷濃度處理下，杉木木質(zhì)素的含量也出現(xiàn)了上升的趨勢(shì)（圖4-B）。綜上，說明磷調(diào)控了ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)量，進(jìn)而影響了杉木木質(zhì)素的生物合成。

3 討論

從ART超級(jí)家族進(jìn)化的歷程來看，KptA/Tpt1基因家族是一類獨(dú)特的RNA處理系統(tǒng)的組成部份，從原核到生物到真核生物普遍存在［15］。ART超級(jí)家族同時(shí)促進(jìn)對(duì)ADP-核糖基化在分子水平上的了解。但是，隨著生物學(xué)的不斷發(fā)展進(jìn)步，近幾年的研究已經(jīng)提出了新的問題。首先，除了通過序列和結(jié)構(gòu)分析確定新的ART家族成員之外，要挖掘ADP-核糖基化過程中蛋白識(shí)別的機(jī)制，以及激活相關(guān)信號(hào)通路中的下游事件。其次，KptA/Tpt1酶蛋白在不同物種中的功能差異性目前還不清楚。

圖4 ClKptA/Tpt1基因的表達(dá)與木質(zhì)素合成的關(guān)系

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)決定蛋白的功能，因此，本論文通過原核表達(dá)的方法在大腸桿菌中對(duì)該基因進(jìn)行了蛋白表達(dá)，其分子量為55.5 kD，該實(shí)驗(yàn)表明IPTG誘導(dǎo)濃度對(duì)蛋白的表達(dá)有一定的影響，本實(shí)驗(yàn)IPTG誘導(dǎo)的最適濃度為0.6 mmol/L。對(duì)蛋白序列進(jìn)行了進(jìn)化樹的構(gòu)建和蛋白跨膜結(jié)構(gòu)以及蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)，得到初步的結(jié)果表明該蛋白不具有跨膜氨基酸，三級(jí)結(jié)構(gòu)主要以α-螺旋、β-折疊的方式存在。通過進(jìn)化樹的比對(duì)，得到該基因氨基酸序列與荷花該基因的氨基酸序列親緣關(guān)系最近，與番茄該基因氨基酸序列的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。蛋白序列對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)ClKptA/Tpt1與其他物種的KptA/Tpt1都含有NADAR 結(jié)構(gòu)域，這與原核生物大腸桿菌和病毒的該蛋白具有高度的相似性［16-17］，說明該基因在進(jìn)化上的保守型。通過對(duì)該蛋的表達(dá)和分析為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了理論基礎(chǔ)。

杉木作為重要的速生用材樹種［18-20］，解析木質(zhì)素生物合成的分子機(jī)制具有重要的意義，但磷對(duì)杉木木質(zhì)素的生物合成的分子機(jī)制目前仍不清楚。因此，本研究通過RT-qPCR分析了ClKptA/Tpt1基因表達(dá)模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達(dá)量最高，在莖中的表達(dá)量最低。用不同濃度的磷處理杉木苗，利用RT-qPCR分析發(fā)現(xiàn)，磷處理后，ClKptA/Tpt1基因在杉木葉中的表達(dá)量隨著磷濃度的增加而增加，說明磷調(diào)控了該基因在杉木葉中的表達(dá)。通過測(cè)定木質(zhì)素含量發(fā)現(xiàn)，隨著磷濃度的增加木質(zhì)素的含量也增加，說明杉木木質(zhì)素的生物合成與ClKptA/Tpt1基因有密切的關(guān)系。

ClKptA/Tpt1基因怎樣影響木質(zhì)素的生物合成目前仍未完全明晰。但有關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥KptA/Tpt1突變體在葉綠體磷酸三糖轉(zhuǎn)運(yùn)體（TPT）中存在缺陷［21］，KptA/Tpt1基因的突變降低了磷酸三糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的活性，導(dǎo)致淀粉含量的積累［21］。Kauder等［22］對(duì)具有反義抑制三磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（KptA/Tpt1-plants）的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株與野生型植株進(jìn)行了比較，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植物的淀粉含量高于野生型，但固定CO2含量不變，說明KptA/Tpt1基因的功能與馬鈴薯淀粉的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。此外，Englert等［23］發(fā)現(xiàn)KptA/Tpt1的N端含有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)信號(hào)肽，但尚不清楚是否在葉綠體和質(zhì)體中，或KptA/Tpt1蛋白酶僅附著于線粒體外膜或被引入這些細(xì)胞器的基質(zhì)中。在藻類中，三棱藻的KptA/Tpt1作為質(zhì)體序列參與葉綠體基因的剪接編碼過程［24］。然而，碳水化合物與木質(zhì)素生物合成呈負(fù)顯著性因素，碳水化合物的增加降低木質(zhì)素的含量［25］。因此，ClKptA/Tpt1基因可能通過影響杉木葉綠體磷酸三糖轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白的活性，進(jìn)而影響了杉木莖中木質(zhì)素的生物合成。

4 結(jié)論

本研究克隆了杉木磷酸轉(zhuǎn)移酶基因ClKptA/Tpt1，獲得了該基因的全長(zhǎng)CDS序列。同時(shí)對(duì)該基因進(jìn)行的原核表達(dá)，獲得了其體外誘導(dǎo)表達(dá)蛋白。表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)該基因在杉木葉中的表達(dá)量最高。此外，在一定范圍內(nèi)的磷處理下，ClKptA/Tpt1的表達(dá)量與磷濃度成正比，杉木莖中木質(zhì)素的含量也隨著磷濃度的增加而增加，磷可調(diào)控該基因的表達(dá)進(jìn)而影響杉木木質(zhì)素的生物合成。