一株耐受高濃度葡萄糖且產乙偶姻菌株的篩選及產物鑒定

霍明月 張鴿 蘇玉龍 李興 張海波 崢嶸 劉好寶

（1. 內蒙古師范大學生命科學與技術學院，呼和浩特 010022；2. 中國科學院青島生物能源與過程研究所 生物基材料重點實驗室，青島266101；3. 云南省煙草公司玉溪市公司元江縣分公司，玉溪 6531005；4. 中國農業科學院煙草研究所 農業部煙草生物學與加工重點實驗室，青島 266101；5. 中國煙草總公司海南省公司海口雪茄研究所，海口 571100）

乙偶姻，又稱3-羥基丁酮，是一種具有奶油香氣的重要風味物質和平臺化合物［1］。1986年，我國衛生部在《食品添加劑使用衛生標準》（GB2760-86）中規定其為允許食用［2］，且在醫藥及煙草工業中都具有廣泛的應用［3-6］。目前，乙偶姻的生產方法有化學合成法、酶學轉化法及微生物發酵法［1］，其中微生物發酵法以微生物為工具、原料來源豐富、工藝條件溫和、其產物具有綠色安全等優點，并且滿足可持續發展理念而日益受到矚目。范宜曉等［7］在食品中分離得到一株產乙偶姻的枯草芽孢桿菌，發酵 96 h 后，乙偶姻產量可達 33.90 g/L。因此，開發有較好性能的高產乙偶姻的新菌株具有較高的理論研究價值和應用意義。

在微生物的發酵中，葡萄糖常用為速效碳源。但是大部分微生物對糖濃度耐受有限，糖濃度過高會使菌株受到高糖滲透應激的影響，導致菌株生長延滯、發酵時間過長，從而影響目的產物產量［8］。工業發酵生產中，常采取分批補料的方法來解決該問題，以期提高產量，但因此不僅增強了染菌風險，也增加了工作成本［9-10］。針對菌株不能耐受高濃度糖這一問題，研究者們通常采用篩選高耐受菌株和利用高糖馴化和菌種誘變選育等方式來提高菌株耐受性。呂春微等［8］通過馴化米根霉菌株從而提高糖耐受性，并且發現耐高糖菌株細胞代謝動力更大，發酵性能較優。陳英［11］對野生釀酒酵母菌株進行紫外誘變，篩選獲得一株在 40%（W/V）葡萄糖壓力下生長，并且提高了產乙醇能力的突變菌株。綜上，篩選出具有高糖耐受度的菌株對細胞的生長，產物的生產效率，營養物質的吸收均產生重要的影響，能簡化發酵工業的生產工藝，對提高產物濃度具有重要意義［12］。

本研究利用篩選培養基從煙田土壤中篩選獲得一株全新的耐受高濃度葡萄糖且產乙偶姻的菌株，然后通過全基因組測序技術和遺傳進化 16S rDNA 序列比對分析對菌株進行鑒定，并將該菌株的發酵產物進一步進行 GC-MS（氣相-質譜）分析。此外，為確定該菌株對葡萄糖的耐受度，初步探索了菌株對不同濃度的葡萄糖耐受實驗。最后，對該菌株進行初步搖瓶發酵實驗，進一步分析該菌株產乙偶姻的能力，旨為該菌株的開發利用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

（1）煙田土壤：取自湖南永州白芒煙草試驗站煙田。（2）主要試劑：乙偶姻標品（97%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），1-萘酚（99.0%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司），肌酸（北京索萊寶科技有限公司），氫氧化鈉（上海國藥集團化學試劑有限公司），葡萄糖（上海國藥集團化學試劑有限公司），胰蛋白胨（OXOID），牛肉膏（上海麥克林生化科技有限公司）等。（3）培養基：耐糖微生物篩選培養基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖400 g/L，瓊脂1.5%，pH 7.0，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。葡萄糖耐受性驗證培養基：胰蛋白胨10 g/L，牛肉膏5 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖設置為100、200、300、400、500 g/L不同濃度，pH 7.0，115℃高壓蒸汽滅菌30 min。LB固體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂15 g/L。LB液體培養基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L。

1.2 方法

1.2.1 微生物篩選 稱取煙田土壤1.0 g，利用5.0 mL無菌水溶解至50 mL無菌離心管中，室溫放置24 h，取1.0 mL上清液置于另一含有9.0 mL無菌水的試管中，混合均勻。利用無菌水進行梯度稀釋［13］分別得到100、10-1、10-2、10-3和10-4不同稀釋度的土壤稀釋液。取不同稀釋度的土壤菌液涂布到耐糖微生物篩選培養基中，37℃培養箱中倒置培養12-16 h，平板劃線法純化篩選到的微生物。

對于耐糖培養基中篩選得到的微生物利用乙偶姻顯色液進行篩選，將顯色液（10% NaOH、5%1-萘酚、0.5%肌酸的溶液按照 1∶1∶1 的比例混合）混合熔化的LB固體培養基，倒入長有目標菌落且含有高濃度葡萄糖的平板上，靜置30 min后觀察顏色變化［14］，選擇能使顯色液呈現粉色的菌株進行保藏鑒定以及發酵產物鑒定。

1.2.2 篩選微生物的葡萄糖耐受性驗證 挑取單菌落，接種至LB液體培養基中，37℃，150 r/min活化過夜培養，獲得種子液。將種子液按照5%的接種量接種至含有50 mL培養基的250 mL搖瓶中，培養基中葡萄糖濃度設置為100、200、300、400和500 g/L，每個葡萄糖濃度設置3 個重復，37℃ 培養36 h，利用分光光度法測定菌株的OD（Optical delnsity）值。

1.2.3 篩選微生物鑒定及進化樹構建 16S rDNA分子鑒定：利用16S rDNA通用引物：27F（5'-3'）：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R（5'-3'）：ACGGCTACCTTGTTACGACTT。PCR反應體系（表1）。PCR程序為：95℃ 預變性，3 min；95℃ 變性，30 s，56℃退火，30 s，72℃延伸，90 s，30個循環；72℃后延伸5 min；4℃，∞。

表1 細菌鑒定體系表

PCR產物利用1%瓊脂糖電泳檢測，片段大小符合理論大小（1 500 bp）的PCR產物送至華大基因公司（http：//www.genomics.cn/index）測序，測序 結 果通 過BLAST（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi）比對獲得鑒定結果，并利用MEGA7.0（Kumar，Stecher，Tamura 2015），選擇neighborjoining 方法構建進化樹，Bootstrap為1 000。

1.2.4 篩選微生物發酵產物檢測 將發酵結束的發酵液以10 000 r/ min 離心3-5 min，獲得發酵液上清，過0.22 μm水相濾膜，送氣相-質譜（GC-MS）檢測進行定性鑒定。氣質檢測條件：DB-5非極性柱，檢測溫度270℃，氣化溫度250℃，柱室初始溫度為50℃，保留2 min，20℃/min升溫到120℃，再以30℃/min升溫到240℃，保持5 min，降溫到50℃，完成檢測，檢測結果與譜庫檢索比對。

1.2.5 篩選微生物發酵產物產量測定 乙偶姻含量測定所需試劑：精確稱取乙偶姻（88.11 g/mol）標準品0.017 62 g溶于100 mL水制成2 mmol/L的乙偶姻溶液。0.5%肌酸，4℃保存；5% 1-萘酚，4℃保存；40% KOH，4℃保存。利用顯色法［14］測定。

標準曲線的制備：將2 mmol/L的乙偶姻溶液梯度稀釋成0.25 mmol/L、0.2 mmol/L、0.15 mmol/L、0.1 mmol/L、0.05 mmol/L，以蒸餾水為對照，分別取上述溶液200 μL于1.5 mL離心管，依次加入140 μL肌酸溶液，200 μL 1-萘酚，200 μL KOH溶液。每加入一種試劑均需渦旋震蕩均勻。所有試劑加完后室溫下溫育15 min，測樣前再次渦旋震蕩，用分光光度計在560 nm波長下測吸光度值，得到乙偶姻溶液吸光度變化與濃度間的標準曲線。

乙偶姻樣品濃度測定：取試樣200 μL于1.5 mL離心管，按照上述顯色步驟進行顯色，560 nm 波長下測吸光度值，嚴格控制顯色時間。

1.2.6 乙偶姻的發酵 挑取單菌落，接種至LB液體培養基中，37℃，150 r/min活化過夜培養，獲得種子液。將種子液按照5%的接種量接種至含有50 mL培養基的250 mL搖瓶中，初始發酵培養基中葡萄糖濃度為100 g/L，測定微生物生長量、培養基中的殘糖量以及乙偶姻產量。發酵期間根據殘糖量結果適當補糖，使培養基中葡萄糖濃度維持在100 g/L，發酵至40 h時培養基中葡萄糖濃度一次性補到200 g/L，直至發酵結束后不再補糖。

2 結果

2.1 微生物篩選

在耐糖培養基上不同稀釋度的土壤稀釋液100、10-1、10-2、10-3和10-4微生物的生長情況也不同。其中，100和10-1平板的微生物種類及數量較多，不易挑出單菌落。10-4平板上沒有長出微生物單菌落。從稀釋度為10-2和10-3的平板上成功篩選到4株單菌落微生物，再將篩選的微生物利用乙偶姻顯色液進行篩選，得一株產乙偶姻的菌株。

2.2 微生物鑒定結果

篩選出的菌體在顯微鏡下呈現球形或稍橢圓形，排列成葡萄狀，無鞭毛，無芽孢。在LB固體培養基表面，菌體形成不透明的淺黃色小菌落，菌落干，邊緣整齊。將測序公司的測序結果提交至NCBI（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）數據庫進行序列比對，得到該菌株與金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），相 似 度99.04%，命名為PX03。菌種保藏編號為：CGMCC No.10671。對該菌株進行全基因組測序，序列提交至NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）數據庫，序列號為NO. LFOJ00000000（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/LFOJ00000000）。利用MEGA7.0 構建進化樹（圖1），結果顯示，PX03 菌株與Staphylococcus aureusstrain 親緣關系更近。

圖1 PX 03進化樹構建結果

2.3 PX03菌株高濃度葡萄糖耐受性驗證

由（圖2）結果可知，不同濃度的葡萄糖對菌株的生長有較顯著的影響，其中在300 g/L的葡萄糖濃度中菌株生長最好，OD600達到了100，在500 g/L的葡萄糖濃度中也可以生長。由此可見，菌株PX03可耐受較高濃度葡萄糖。

圖2 PX03 菌株對高濃度葡萄糖耐受性結果

2.4 發酵產物鑒定

對該菌株發酵產物做 GC-MS 定性分析結果（圖3，表2）顯示，發現可產較豐富的香氣物質，其中主要產物為乙偶姻（22.51%）和2，3-丁二醇（21.29%）大量的香氣成分，還同時產乙酸（13.97%）、3，4-二羥基-3，4-二甲基己烷-2，5-二酮（8.52%）、吡 喃 酮（5.24%）、3-甲 基-丁 酸（4.47%）、2-乙基-丁酸（0.5%）、糠醛（0.25%）、2，4-二羥基-2，5-二甲基-3（2 h）-呋喃-3-酮（0.14%）和菠蘿酮（0.32%）等少量的香氣成分。

圖3 發酵產物GC-MS定性檢測結果

2.5 PX03菌株發酵產乙偶姻結果

繪制乙偶姻標準曲線為：Y=659.907 04×X-0.849 36，R2=0.998.

為了進一步探究菌株PX03的生長和產乙偶姻的情況，對其進行了搖瓶發酵。發酵結果（圖4）顯示，

OD600值和乙偶姻產量隨著時間的推移是向上升高的趨勢，但是在發酵期間出現了幾個下降的點，OD600值分別是在 16 h、36 h和44 h時出現了下降，乙偶姻產量在 20 h和 44 h時出現了下降。最終，在發酵72 h 后，菌株 OD600值最高可達到 66，乙偶姻產量達到 41 g/L。該野生菌株是目前已報道較高產量的乙偶姻發酵菌株。初步發酵結果證明該菌株具有較好的乙偶姻生產潛力。

表2 菌株發酵液氣相-質譜（GC-MS）結果分析

圖4 PX03菌株生長及發酵產乙偶姻產量

3 討論

隨著人們生活水平的不斷提高，乙偶姻的用量在食品、醫藥以及煙草工業中不斷增長，微生物發酵生產方法有諸多優點而引起人們的廣泛關注。自然界中能以糖質原料天然合成乙偶姻的微生物主要有腸桿菌屬、沙雷氏菌屬、克雷伯氏菌屬、乳球菌屬和芽孢桿菌屬等［15］。Roncal 等［5］利用一株乳球菌亞種突變株 CML B4 進行乙偶姻發酵，乙偶姻產量可達到 40 g/L，分批發酵可達 59 g/L。Li 等［16］將野生型地衣芽孢桿菌 WX-02 經代謝工程及發酵控制優化，分批發酵 96 h 乙偶姻產量達 78.79 g/L。Zhang等［17］將陰溝腸桿菌經乙偶姻還原酶和副產物途徑失活，輔助因子工程等策略，乙偶姻發酵產量達到55.22 g/L。本研究對金黃色葡萄球菌 PX03 進行搖瓶發酵實驗，在發酵期間由于菌株自身的生長周期的特點以及前期根據殘糖量適當補糖至100 g/L，在發酵到40 h時培養基中葡萄糖濃度一次性補到200 g/L導致OD600出現了多個拐點。由于菌株的濃度和生長活力對產物的產量有較大的影響，所以隨著OD600的變化乙偶姻的產量也出現了變化；另一方面，在乙偶姻生物合成中，乙偶姻可被乙偶姻還原酶/2，3-丁二醇脫羧酶（AR/BDH）還原為2，3-丁二醇，在一定條件下2，3-丁二醇也會被逆向轉化為乙偶姻［18］。通過基因工程平衡兩種產物的研究也逐漸深入，該菌株的獲得為乙偶姻的分子操作進一步奠定了基因基礎。最終，初步發酵 72 h 后菌株 OD600值最高可達到 66，乙偶姻產量可達 41 g/L，為高產乙偶姻提供了新菌株，對乙偶姻的發酵生產具有重要意義。但是乙偶姻發酵產量還有待進一步提高。發酵培養基成分及發酵參數對微生物發酵結果至關重要，Xiao等［19］對產乙偶姻發酵培養基進行了優化，搖瓶水平上產物產量達 37.90 g/L。后期實驗中，對該菌株進行高糖發酵條件優化對提升乙偶姻產量具有重要意義。

葡萄糖是常見的微生物發酵底物，一般微生物發酵時底物濃度過高會使微生物生長受到限制，因而高滲微生物在發酵工業中應用前景廣泛。李夢琦等［20］篩選得到一株能在 550 g/L 葡萄糖培養基上生長的耐高糖且產香的魯氏酵母菌株。目前對高滲微生物的研究主要集中在酵母高糖耐受機制研究中［21-22］，由于酵母菌安全性高且富含多種營養物質而被廣泛應用，但是酵母菌生長緩慢，發酵周期長。而原核生物有容易培養，易于改造，發酵周期短等優勢。本研究通過分子鑒定，確定 PX03 菌株為金黃色葡萄球菌，是條件致病菌［23］。PX03 菌株在發酵產乙偶姻和高糖耐受性方面具有較明顯優勢。實驗結果證明 PX03 在 500 g/L的葡萄糖濃度中依然能生長，最適葡萄糖濃度為 300 g/L，能耐受較高葡萄糖濃度。該菌株為進一步提高乙偶姻產量的高糖底物發酵及發酵時的耐糖機制研究奠定菌株基礎。菌株測序后，結合分子生物學的發展，利用基因操作實現乙偶姻合成代謝途徑構建及增強等研究逐漸增多［24-27］。

此外，基于前期本研究組關于雪茄煙葉發酵中微生物群落演替研究及分離鑒定結果，葡萄球菌屬在雪茄煙葉發酵微生物群落中占有較大比重［28-29］，結合國內關于熏肉及火腿等食品研究發現，葡萄球菌屬在食品的增香提質中起著重要作用［30-31］。另外，結合本研究中對菌株發酵產物的 GC-MS 檢測結果，該菌株發酵產物中香氣成分豐富，有望在雪茄煙葉發酵提質增香中發揮作用。

4 結論

本研究從煙田土壤中篩選得到菌株PX03，經過分子鑒定為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），相似度為 99.04%。該菌株對高濃度葡萄糖有較好耐受性，在 300 g/L葡萄糖濃度下生長最好，在 500 g/L的葡萄糖濃度中依然能生長。此外，對該菌株的發酵產物用 GC-MS 鑒定出豐富的香氣成分，其中主要香氣成分是乙偶姻和2，3-丁二醇，最后對該菌株進行初步搖瓶發酵，乙偶姻產量可達到 41 g/L。