白蟻腸道木質素降解菌分離鑒定及其降解特性

李鋒 黃庶識

（1. 黔南民族師范學院化學化工學院，都勻 558000；2. 廣西科學院 廣西海洋天然產物與組合生物合成重點實驗室，南寧 530007）

隨著化石能源的過度消耗及環境污染的日益嚴重，尋求可再生、環境友好的替代品成為當今研究熱點。植物每年通過光合作用生成資源豐富的木質纖維素，其中木質素是自然界中唯一可再生的芳香族聚合物。處理不當會對環境造成污染，如我國每年的農作物秸稈資源豐富，大部分以燃燒的方式進行處理，從而加劇了大氣污染。此外，我國造紙工業產生的黑液廢水主要成分為木質素，如果不進行處理直接排放，會污染水源甚至可能會對人類健康帶來一定的威脅。因此，探索木質素有效分解并轉化為高附加值化學品資源等方面的研究，對人類健康及環境可持續發展具有重要的意義。

自然界生物圈經過長期的進化和演變，存在著許多可以降解木質素的系統，如細菌、真菌、食木昆蟲和食草動物等，它們都可以將木質素進行不同程度的分解。其中白蟻腸道消化系統被認為是高效木質纖維素轉化反應器。相關研究發現，白蟻腸道內寄居著大量形態和密度都不同的細菌，每只白蟻腸道中約可達106-108個［1］。通過高通量測序和分離培養的方法已經對將近40多種白蟻進行了腸道細菌多樣性分布研究。Lazuka等［2］在厭氧條件下對Nasutitermes ephratae腸道細菌進行富集，富集后的菌群多樣性明顯發生變化，經5次富集后得到菌群TWS培養12 d可以降解42%的麥稈，菌群TWS主要由擬桿菌屬（Bacteroides）和毛螺科菌（Lachnospiraceae）的細菌組成。此外，白蟻腸道共生細菌受物理環境等因素的影響，其多樣性分布情況存在較大差異。利用宏基因組對高等食木瓢白蟻（Bulbitermessp.）的前腸、中腸和后腸分別進行測序，發現前腸和中腸存在相似的多樣性，而后腸中細菌多樣性明顯比前兩者豐富。其中前腸和中腸優勢菌為硬壁菌門的桿菌（Bacilli）、梭菌（Clostridia）和放線菌門的放線菌目細菌（Actinomycetales），而后腸主要為螺旋體門的螺旋體科細菌［3］。

在木質素降解菌分離純培養方面，Zhou等［4］利用木質素作為碳源，從黑胸散白蟻腸道中分離到腸桿菌PY12（Enterobacter hormaechei）和芽孢桿菌 MX5（Bacillus licheniformis），二者表現出較高木質素過氧化物酶活力分別為278 U/L和256 U/L，對木質素過氧化酶進行異源表達，該酶表現出對多種染料有較強脫色能力。Suman等［5］從土白蟻（Odontotermes obesus）腸道中分離到一株特布爾希氏菌（Trabulsiellasp.），表現出較強木質素降解能力，其木質素降解產物檢測到許多芳香族化合物，如3-甲氧基苯甲酸、鄰苯二酚、鄰苯二甲酸等。Tsegaye等［6］以堿木質素、羧甲基纖維素和木聚糖為碳源，從麻頭堆砂白蟻（Cryptotermes brevis）腸道分離到芽孢桿菌（Bacillussp.）BMP01和水稻蒼白桿菌（Ochrobactrum oryzae）BMP03，其中芽孢桿菌具有較強的纖維素和木聚糖水解的能力，水稻蒼白桿菌表現出較高的漆酶和木質素過氧化酶酶活力。此外，以水稻秸稈為碳源培養14 d后，水稻蒼白桿菌可去除秸稈中53.74%木質素［7］。

以上這些研究表明白蟻腸道是儲存木質纖維素降解細菌的資源庫，具備挖掘新穎木質素降解菌及酶資源的潛力。本研究以堿木質素為唯一碳源，篩選分離白蟻腸道中潛在的木質素降解菌，對其進行分子生物學鑒定，并進一步解析其木質素的降解特性，旨在為木質素生物降解轉化提供新穎微生物資源和理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 高等白蟻采集于中國科學院西雙版納熱帶植物園次生雨林，經兵蟻形態特征及COⅡ基因序列鑒定為巴基斯坦小白蟻（Microtermes pakistanicus）。

1.1.2 培養基 分離培養基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO40.2，CaCl20.1，FeSO40.05，MnSO40.02，CuSO40.001，ZnSO40.001，tryptone 0.05 瓊脂粉 15，堿木質素1.0。

染 料 脫 色 固 體 培 養 基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，tryptone 0.05，瓊 脂 粉15，pH 7.2，滅菌后，再分別加入100 mg經0.22 μm過濾滅菌的染料（苯胺藍和天青B）；

MSM液 體 培 養 基（g/L）：K2HPO41，KH2PO41，（NH4）2SO42，MgSO4·7H2O 0.2，CaCl20.1，FeSO4·7H2O 0.05，MnSO4·H2O 0.02，CuSO4·5H2O 0.001，ZnSO4·7H2O 0.001，tryptone 0.05，堿木質素1.0，pH 7.0左右。

以上所述培養基均為115℃，滅菌15 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株分離純化及鑒定 取巴基斯坦小白蟻的工蟻30頭，用75% 酒精對白蟻表面消毒后，在中性PBS緩沖液中漂洗2-3次。于無菌條件下，解剖白蟻腸道置于無菌0.9% 生理鹽水中，然后將其研磨成勻漿狀態。腸道勻漿液用無菌生理鹽水梯度稀釋后，取100 μL溶液涂布于分固體分離培養基的平板上，置于30℃，培養2-5 d。待有單菌落長出后，挑取單菌落，在液體LB培養基過夜培養，重新劃線于分離培養基平板中，進行多次劃線分離培養，直至獲得純菌株。

將單克隆接種于LB培養基，過夜培養，取1 mL培養液于離心管中，12 000 r/min離心2 min后棄上清液，菌體經無菌水漂洗后，用細菌基因組試劑盒進行DNA提取。獲得細菌基因組后進行16S rRNA 基因擴增，具體擴增條件參考文獻［8］。PCR產物經1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測后，委托上海生工對細菌基因序列進行雙向測序。將測序完成的16S rRNA 基因序列拼接后，提交至NCBI網站的GenBank數據庫，并進行BLASTn（www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）同源性相似度比對。下載比對序列同源性較高的菌株序列，利用MEGA 5.05 軟件計算序列相似度，同時用Neighbor-Joining 法構建菌株系統發育樹，確定物種的分類地位。

1.2.2 細菌胞外酶定性檢測 利用染料脫色來評價細菌是否能夠產胞外分泌酶的能力，通過檢驗細菌對染料的脫色能力，達到對細菌進一步復篩目的。挑取單克隆于LB培養基中過夜培養后，接種環取菌液劃線于染料固體培養基上，置于30℃恒溫培養箱中培養，每天觀察菌株的生長情況以及是否有脫色圈產生。

1.2.3 細菌木質素降解率測定 在有氧條件下，細菌接種于MSM液體培養基后，每隔24 h 取樣。細菌生長曲線按照如下步驟測定：取2 mL發酵液，經10 000 r/min 離心5 min后，棄上清液，底物菌體用去離子水重懸后，在波長600 nm處測定吸光度OD值，去離子水為空白對照。培養基中堿木質素濃度以溶液中化學需氧量（COD）為考察指標，采用重鉻酸鉀法測定COD（GB11914-89），離心后的上清液經一定倍數稀釋后，經消解儀消解樣品后，利用5B-3B型多功能COD快速測定儀測定COD值。以上實驗均為3個平行試驗。

1.2.4 細菌木質素降胞外酶活力測定 細菌降解木質素胞外漆酶（Lac）、木質素過氧化物酶（Lip）和錳過氧化物酶（MnP）測定具體操作步驟參考文獻［9］。

1.2.5 掃描電子顯微鏡觀察 未接菌的培養液作為對照試驗組和經細菌處理7 d后的一定量發酵液經冷凍干燥后，取木質素粉末經乙醇洗滌去除殘留物，烘干后備用，分別取少量干燥木質素樣品涂布于雙面導電膠上，經噴金處理后，進行JSM-7800F場發射掃描電子顯微鏡（日本電子株式會社）觀察和拍照。

1.2.6 傅里葉變換紅外光譜分析 木質素紅外光譜（Nicolet nexus 470 傅里葉變換紅外光譜儀，美國尼高力儀器公司）采集采用溴化鉀壓片法，分別取一定量經過干燥的接菌和未接菌的木質素樣品，木質素樣品和溴化鉀按質量比為1∶100混合均勻后，將其研磨至成粉末，制備成厚度均勻薄片后，采集紅外圖譜，以純溴化鉀為背景，波長掃描范圍4 000至400 cm-1，分辨率為4 cm-1。

1.2.7 熱解特性分析 木質素熱穩定分析采用TGA4000熱重分析儀（Thermo-gravimetric annlyzer，TGA，美國珀金埃爾默），取大約2 mg 未經細菌處理和經過細菌處理的木質素樣品，分析放入樣品盤后，溫度從50℃開始升溫至800℃結束，升溫速度為20℃/min，氮氣流速為20 mL/min。每個實驗重復3次。

2 結果

2.1 木質素降解菌篩選分離與鑒定

2.1.1 木質素降解菌篩選分離 待固體分離培養基上長出單菌落后，挑取單菌落繼續進行劃線分離多次培養后，將單菌落接種于固體分離培養基，挑取生長速度快和菌落個體較大的細菌進行編號并保藏。為了直觀評價細菌分泌胞外木質素降解相關酶的能力，本研究采用較為常用的天青B和苯胺藍作為底物，對細菌脫色能力進行評價。將菌株接種于染料培養基過夜培養后，發現菌株MP-132能夠使天青B和苯胺藍脫色（圖1）。由圖1可知，菌株MP-132在染料誘導的情況下，可以分泌胞外酶將其脫色。染料脫色只能定性判斷產酶情況，但是，該菌分泌哪種類型的酶及其酶活大小還需進一步分析。

圖1 菌株MP-132的染料脫色評價

2.1.2 木質素降解菌的16S rRNA 基因序列分析 雙向測序獲得菌株MP-132的16S rRNA 基因序列，經RNAMAN序列拼接后，提交至GenBank 數據庫，序列登錄號為MF455198，同時在NCBI數據庫中進行序列同源性比對，選取BLAST中相似度較高的細菌序列，并下載相關序列后，利用MEGA5.05計算細菌序列相似度，同時采用其中的Neighbor Joining法構建細菌系統發育樹。如圖2所示，MP-132與Raoultella ornithinolyticastrain ATCC 31898在同一個分支上，序列相似性為99%。因此，將該菌株初步命名為Raoultella ornithinolyticaMP-132。

2.2 木質素降解菌的生長及酶活力分析

2.2.1 木質素降解菌的生長情況及降解率測定 為了解菌株MP-132在液體堿木質素中的生長及木質素降解情況，將細菌分別接種于以堿木質素為唯一碳源的無機鹽培養基中，因堿木質素是培養基中唯一提供的有機物質，所以采用COD去除率作為指標，評價堿木質素降解率。由圖3可知，菌株MP-132前4 d菌體呈現迅速生長趨勢，第4天后菌體OD值達到0.87，隨后OD曲線呈現平緩增長趨勢，第6天OD值增長到0.913，OD數值變化不大。液體培養基中COD濃度變化曲線，前兩天降低速度緩慢，第2天開始繼續開始下降，可能是與細菌活性和濃度有關，直到第7天培養基中COD濃度為842.7 mg/L，降解率達到53.2%，后期COD去除率變化緩慢，由此表明降解產物的累積使菌體代謝活性受到影響。

圖2 菌株MP-132的16S rRNA基因序列系統發育樹

圖3 菌株MP-132在堿木質素培養基中的生長及COD去除率

2.2.2 木質素降解菌的酶活力測定 由圖4可知，細菌在堿木質素培養基生長過程中沒有檢測到錳過氧化物酶活力，只檢測到漆酶和木質素過氧化物酶。由木質素過氧化物酶的增加速率趨勢分析發現，培養2 d后LiP增長速率放緩，第4天LiP達到最大值為105.6 U/L，隨著培養時間增加，其酶活力開始出現下降趨勢，可能是由于細菌衰老，其代謝活力降低，從而導致酶活力出現下降趨勢。在木質素降解過程中，Lac酶活力在第2天達到27.53 U/L，即使隨著培養時間的增加，Lac酶活力在第3天達到最大值32 U/L。菌株MP-132所產LiP和Lac酶活力明顯低于以前報道的白腐菌和其他類細菌所產的酶活，可能是受發酵參數影響，如溫度、溶氧量和pH等，后續研究應該對其發酵過程進行條件優化。

2.3 菌株MP-132的降解特性

圖4 木質素降解過程中菌株MP-132酶活曲線

2.3.1 木質素微觀結構分析 菌株MP-132處理前后的堿木質素形貌進行掃描電鏡觀察分析比較。如圖5中所示，圖5-A為在放大倍數為1 000倍狀態下，未處理堿木質素呈現的結構狀態，其呈球形或者塊狀，且表面相對光滑，完整致密。圖5-B為細菌處理后的堿木質素在放大倍數1 000倍狀態下，呈現的堿木質素微觀結構。經過細菌降解后的堿木質素已經沒有規則的球形或者塊狀結構，且呈現疏松多孔的表面，甚至出現許多片狀顆粒，它們的直徑都小于10 μm。經對比木質素降解前后微觀結構變化情況，證實細菌都可以通過分泌胞外酶使堿木質素微觀結構遭到嚴重的破壞。

圖5 木質素降解前后的微觀結構

2.3.2 木質素的FTIR分析 由圖6可知，是經菌株MP-132降解前后的堿木質素的紅外光譜圖。由圖可知，經過細菌降解的木質素的特征峰強度減小或者發生漂移，木質素特征峰變化也是主要集中于1 800 /cm-800/cm的指紋區。1 596 /cm和1 513/cm處吸收峰歸屬于芳香環骨架振動和C-H變形振動，1 456/cm和 1 424/cm處吸收峰是由于甲氧基的甲基C-H不對稱變形，1 374/cm處吸收峰歸屬于甲基和酚羥基的C-H的伸縮引起。此外還存在1 268/cm、1 217/cm處吸收峰是典型愈創木酚基結構（G），1 126/cm處是典型紫丁香基（S）的吸收峰。1 082、1 033、967 和880/cm處吸收峰分別歸屬于Cβ和脂肪醚的C-O變形，以及苯環C-H面內變形振動、苯環C-H面外伸縮振動和C-H變形振動。細菌降解后木質素的多個吸收峰消失，如1 374、1 151、1 082、967、880、854和 816/cm， 以 及1 596、1 513、1 456、1 424、1 268和 1 033/cm處的幾個吸收峰相對吸收強度減小，上述多個吸收峰的變化表明菌株MP-132使堿木質素的側鏈、C=O、C-O和芳香環骨架結構遭到破壞。

圖6 木質素降解前后的紅外光譜圖

2.3.3 木質素的熱解特性分析 堿木質素熱解性質與其芳香環骨架結構及在不同溫度下化學鍵裂解所需要的鍵能有著密切的關系，可以作為評判木質素結構變化的考核參數。在升溫速度為20℃/min條件下，降解前后的木質素樣品進行熱重分析，得到TG曲線。由圖7中TG曲線可知，降解前后的木質素的熱穩定性存在較大差異，主要表現在熱分解反應的起始和終止溫度、失重速率和失重峰值點等。細菌降解前后木質素樣品均呈現兩個重量損失階段。第一階段發生在100-180℃范圍內的重量損失；細菌處理堿木質素第二階段重量損失從180℃開始，一直升溫至640℃終止，最終得到剩余殘渣質量達到60%。而未處理堿木質素在從200℃開始一直升溫至800℃，有明顯的重量損失，最終剩余殘渣為29.3%。

圖7 木質素降解前后TG曲線

3 討論

木質素由多種化學鍵構成的大分子聚合物，在自然界中的儲量僅次于纖維素，如將其高值化利用對改善能源結構具有重要的意義。細菌具有生長速度快，適應環境能力強和基因易操控等優點，備受國內外研究者的青睞。近年來，關于細菌降解木質素研究逐漸增多，同時對木質素降解機制也逐漸補充完善。如Zhu等［10］從南海深海海泥中篩選到一株嗜堿菌Bacillus ligniniphilusL1，通過基因組和蛋白組測序發現該菌擁有木質素主要代謝途徑：苯甲酸代謝途徑、龍膽酸代謝途徑和β-酮己二酸代謝途徑。Higuchi等［11］從Sphingobiumsp. YK-6基因組中鑒定到兩個新穎基因編碼的酶，可以催化裂解芳基醇-β-芳醚結構，并發現存在可以將木質素轉化為高附加值化學品（2-吡喃酮-4，6二甲酸）的HPV代謝途徑。以上研究表明，挖掘自然界中木質素降解細菌具有較大潛力。

Raoultella屬細菌是廣泛存在生態環境中的一類革蘭氏陰性細菌，具備降解多種有機污染物的能力［12-14］。本研究從高等食木白蟻腸道中分離得到一株可降解木質素的菌株MP-132，經分子生物學鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌。進一步對其降解木質素試驗分析，培養7 d后其木質素降解率可達53.2%，明顯高于已報道的Burkholderiasp. H1［15］，其降解率可能受環境條件，如溫度、溶氧量和pH等，后續需優化培養條件提高木質素降解率。在木質素降解變化的化學官能團方面：如1 374/cm處的吸收峰消失，表明降解后的木質素可能是發生側鏈被氧化、脫去甲基以及芳香環骨架受到破壞［16］。在1 142/cm處消失的特征峰，其歸屬于醚鍵的伸縮振動，由此表明細菌在一定程度上對木質素的主要化學鍵β-O-4造成了破壞。其次，木質素降解前后熱解特性發生變化，表明樣品中化學鍵和官能團含量經過細菌處理以后發生改變。在200-350℃范圍內，處理過的堿木質素擁有較高的熱分解速率（與對照樣品相比），這一階段的熱分解主要是側鏈和一些鍵能低的化學鍵的斷裂，如側鏈的β-γ碳碳鍵、β或γ位的OH、β-O-4的C-O鍵等［17］。在350-400℃范圍內，這一階段主要是側鏈被氧化，如脂肪羥基的羧基化或者羰基化和側鏈的脫羥基［18］。當溫度高于400℃，木質素熱分解主要歸因于木質素芳香環骨架的C-C鍵（主要是5-5'和 β-β'）的裂解以及脫甲氧基［19］。

此外，在木質素降解過程中未發現錳過氧化物酶活力，可能是由其他種類同工酶發揮著MnP的作用。并且已有研究表明由于木質素結構復雜，其降解過程需要多種酶參與完成，如細胞色素P450單加氧酶、過氧化氫酶、多功能氧化酶、乙二醛氧化酶、芳醇氧化酶和葡萄糖氧化酶等［20-21］。木質素結構復雜，其降解酶系不能只通過評價目前研究中所報道的3種酶，后期應利用現有先進技術手段（如分泌蛋白組學）對其降解酶系進行宏觀性評價。鮑文英等［22］從土壤中分離得到一株Raoultella ornithinolyticaS12進行基因組測序，其基因組中存在大量與木質素降解相關酶類的編碼基因，如漆酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、兒茶酚-1，2-雙加氧酶和原兒茶酸-3，4-雙加氧酶等，這些基因在以堿木質素為碳源的培養條件下的表達量，均高于以葡萄糖為碳源培養的。菌株MP-132與Raoultella ornithinolyticaS12屬于同一種細菌，其木質素降解機制可能存在較大的相似性，但兩個細菌來源不同，其潛在的差異性還需進一步利用先進系統生物學和先進化學分析手段進行研究，為完善細菌降解木質素機制提供科學理論依據。

4 結論

本研究從白蟻腸道篩選分離到一株可降解木質素的菌株MP-132，經鑒定為解鳥氨酸拉烏爾菌（GenBank登錄號MF455198）。該菌能夠利用堿木質素為唯一碳源生長，定性和定量檢測其可分泌胞外漆酶和木質素過氧化物酶，并通過觀察木質素降解前后的微觀形貌發生明顯變化。此外，細菌生物處理后木質素的官能團結構和熱解特性也發現改變。在以堿木質素為碳源培養過程中，在第7天時，其降解率可達53.2%，LiP和Lac酶活力分別達到最大值為105.6 U/L和 32 U/L。本研究系統研究了拉烏爾屬細菌降解木質素的特性，該菌具備木質素降解能力，為豐富木質素降解微生物提供了優良菌株資源。