GLN1基因過表達對提高釀酒酵母糠醛耐受性的研究

吳宇 王金華 趙筱

（湖北工業大學生物工程與食品學院，武漢 430068）

我國是一個農業大國，廢棄的秸稈給我國帶來了嚴重的負面影響，燃燒秸稈的方式不僅造成了能源的浪費，還會對環境造成極大的污染，如果將廢棄的秸稈制備成水解液，利用釀酒酵母的分解作用，可將其轉化為纖維乙醇，作為生物能源使用。

利用釀酒酵母生產纖維乙醇具有很大的優勢，當釀酒酵母大量繁殖時，可以抑制其他有害微生物的繁殖，并且釀酒酵母在發酵過程中啟酵快，發酵充分，最終酒精產量高［1］。由于秸稈水解液中含有許多對酵母菌生長抑制的物質，如糠醛、弱酸以及酚類等，其中糠醛的抑制作用很強，它能誘導酵母細胞內ROS的積累，從而損傷細胞線粒體和液泡膜［2］。酵母在將糠醛還原成糠醇時，其轉化過程會導致輔酶的大量消耗，從而影響胞內代謝，并會造成抗氧化蛋白的失活，使得酵母細胞受到氧化性破壞［3］。

為提高酵母菌對水解液抑制物的耐受性，科研人員利用了自然選育、馴化、誘變育種、雜交育種、原生質體融合和基因工程等技術。鄒姝姝等［4］通過對耐酸酵母菌的自然選育實驗，挑取了4個能耐受pH 1.50的酒用酵母菌株。張譯之等［5］利用馴化和紫外誘變相結合的手段處理釀酒酵母，再通過分離篩選，獲得了3株抑制物耐受能力高于出發菌株的突變菌株。林貝等［6］采用紫外誘變結合馴化對工業釀酒酵母進行選育，在復合抑制劑存在下，優勢菌株發酵時間為48 h，乙醇平均產率0.19 g/（L·h），相比原始菌株，優勢菌株發酵時間縮短65.22%，乙醇平均產率提高2.17倍。方佩佩等［7］采用大氣壓等離子體技術對釀酒酵母進行誘變，獲得了一株發酵液酒精含量達18.24%的菌株，其產酒精能力提高了27.51%。吳帥等［8］用釀酒酵母AY-15，M1進行雜交育種試驗，得到了一株在高滲環境中仍然保持較高產酒精能力的釀酒酵母，其在含鹽5%的培養基中，產酒精能力分別比AY-15，M1提高了19.6%和15.4%。茍敏等［9］利用原生質體融合技術選育耐酸絮凝性釀酒酵母，通過對融合子的篩選獲得了一株乙醇收率比親本菌株高9.8%的菌株。Wan等［10］在培養基中加入硫酸鋅后，酵母的乙酸耐受能力得到提升，并測得胞內丙氨酸含量是對照培養物含量的3.51倍，隨后在培養基中添加0.5 g/L的丙氨酸，發現在乙酸存在的條件下糖耗速率加快，ROS積累減少，說明丙氨酸可作為ROS清除劑。利用基因工程的技術能夠定向改造酵母，通過改變胞內的能量代謝、丙氨酸代謝、谷氨酸代謝、甘油代謝、脯氨酸代謝、肌醇代謝以及改變胞內谷胱甘肽抗氧化系統來提高菌體對抑制物的耐受能力。何艷艷等［11］在釀酒酵母中過表達了LCB4基因，其編碼的長鏈鞘氨醇激酶使發酵液中的甘油、海藻糖以及琥珀酸的含量提高，這些物質有利于增強菌株的抑制物耐受性，在3 g/L糠醛的發酵過程中，重組菌株的乙醇發酵產率達到了0.76 g/（L·h），且比對照菌株提高了85.4%，發酵時間縮短了30 h。相瑞娟［12］先通過基因工程改造等手段實現膜轉運蛋白基因MDR1和ADP1的過表達來構建抗性提高的釀酒酵母，再通過定向馴化來篩選具有良好抑制物抗性的酵母菌株。張克俞等［13］過表達了IMP環水解酶基因ADE17，使得酵母的最大乙醇生產強度達到了0.669 g/（L·h），較對照菌株提高了42.6%，發酵周期也縮短了23 h。Chen等［14］通過轉錄組分析方法發現多個基因在糠醛存在條件下表達上調，選擇基因ACE2和SFP1進行過表達，使得過表達菌株在糠醛脅迫條件下的乙醇生產強度提高了4倍。Kim［15］過表達了谷胱甘肽合成路徑的基因GSH1和GLR1，加強了細胞對糠醛的耐受能力。陳洪奇［16］研究了在10 g/L乙酸脅迫條件下，GLN1基因的表達水平和蛋白水平在添加硫酸鋅后均上調，說明GLN1基因在提高酵母菌的抗逆性中起到了一定的作用。GLN1是編碼谷氨酰胺合成酶的基因，能促進谷氨酰胺的合成。對于谷氨酰胺合成代謝途徑是否能提高酵母糠醛耐受性的問題，目前還鮮有報導。

為克服糠醛對纖維乙醇生產的影響，我們擬將基因GLN1插入載體pESC-URA中，再導入釀酒酵母BY4741，促進胞內谷氨酰胺的合成，進一步轉化為谷胱甘肽，使得胞內谷胱甘肽抗氧化系統的水平得到提升，進而降低ROS的含量，使酵母細胞的抗糠醛脅迫能力得到增強，從而使產乙醇的效率得到提升。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質粒 出發菌株為酵母菌BY4741，由本實驗室保存；質粒pUC19，由本實驗室保存；質粒pESC-URA，由本實驗室保存。

1.1.2 主要試劑與儀器 氨芐青霉素購自Mersco公司；PCR 引物合成由南京金斯瑞生物科技有限公司合 成；DL5000 DNA Marker、Yeast RNAiso Kit購 自寶生物工程（大連）有限公司；變性鮭魚精DNA購自北京雷根生物技術有限公司；酵母SC-URA培養基購自上海百風生物科技有限公司；2×Accurate Taq預混液（含染料）、DNA Ligation Kit購自湖南艾科瑞生物工程有限公司；T5核酸外切酶購自新海基因檢測有限公司；谷氨酰胺合成酶（GS）活性檢測試劑盒檢測購自北京索萊寶科技有限公司；NAD+/NADH檢測試劑盒購自碧云天公司。

SBA-40D型生物傳感分析儀（濟南研科實驗儀器有限公司），Waters e 2695型高效液相色譜儀（美國Waters 公司），mycycler PCR 儀（美國Bio-Rad 公司），ABI 7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）。

1.1.3 培養基 液體培養基：LB液體培養基、YPD液體培養基；固體培養基：LB固體培養基、YPD固體培養基、酵母SC-URA固體培養基；選擇培養基：LB培養基加抗生素（50 mg/L氨芐青霉素）；糠醛耐受培養基：蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖20 g/L、糠醛1.55 g/L；模擬水解液培養基：蛋白胨20 g/L、酵母粉10 g/L、葡萄糖47.8 g/L、糠醛1.1g/L。

1.2 方法

1.2.1 酵母工程菌的構建及驗證

1.2.1.1 重組質粒的構建與轉化 根據GLN1基因序列設計擴增引物P1和P2，如表1所示，該對引物下劃線序列與GLN1基因序列同源，兩邊各有20 bp與質粒pUC19序列同源的同源臂，將目的基因GLN1與經BamHⅠ和Hind Ⅲ雙酶切后的pUC19質粒按照摩爾比為2∶1的比例混合，再向離心管中加入T5核酸外切酶，30℃反應40 min，于冰上停止反應，待100 μL感受態細胞解凍后，向其加入5 μL反應液，混勻后置于冰上30 min，然后42℃熱沖擊60 s，隨后放置冰上2 min，加入900 μL的LB液體培養基，于37℃，250 r/min的搖床中培養1h，培養結束后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，于37℃恒溫培養12-16 h，對平板上長出的菌落用驗證引物P3、P4進行驗證，驗證成功后，將質粒命名為“pUCGLN1”。然后用T4 DNA連接酶將質粒pUC-GLN1與質粒pESC-URA進行連接，先將兩質粒用限制性核酸內切酶BamHⅠ和Hind Ⅲ分別進行雙酶切，隨后對酶切體系進行切膠回收，按照2∶1的摩爾比加入酶切后的質粒pUC-GLN1與酶切后的質粒pESCURA，再向離心管中加入T4 DNA連接酶，16℃反應30 min，于冰上停止反應，待100 μL感受態細胞解凍后，向其加入5 μL反應液，混勻后置于冰上30 min，然后42℃熱沖擊60 s，隨后放置冰上2 min，加入900 μL的LB液體培養基，于37℃，250 r/min的搖床中培養1 h，培養結束后取100 μL菌液涂布于氨芐抗性平板上，于37℃恒溫培養12-16 h，對平板上長出的菌落用驗證引物P5、P6進行驗證，驗證成功后，將質粒命名為“pESC-GLN1”。

表1 實驗所需的引物

重組質粒pESC-GLN1構建成功后，用醋酸鋰轉化法［17］將重組質粒轉化到BY4741細胞中，將酵母BY4741培養在50 mL液體培養基中，于30℃、200 r/min振蕩過夜，用顯微鏡計數算出酵母的密度，然后接種酵母于50 mL液體培養基中，使得酵母密度為5×106個/mL。將搖瓶置于30℃、200 r/min培養3-5 h，當酵母密度為2×107個/mL時，將菌液倒入50 mL無菌離心管，于2 500 r/min、4℃離心5 min，棄上清，加入25 mL預冷無菌水，重懸菌柄，重復上述離心操作后棄上清，加入1 mL預冷的濃度為100 mmol/L的LiAc，重懸后轉移至1.5 mL無菌離心管，于10 000 r/min、4℃離心5 min，用移液器吸盡LiAc，再加入0.4 mL濃度為100 mmol/L的LiAc重懸，隨后取50 μL的細胞懸浮液于1.5 mL干凈離心管，于10 000 r/min、4℃離心5 min，再用移液器吸盡LiAc，按順序依次向離心管中加入50%PEG3350 240 μL、1 mol/L LiAc 36 μL、2 g/L變性鮭魚精DNA 25 μL、預冷無菌水50 μL以及重組質粒10 μg，充分混合后，置于30℃水浴鍋中保溫30 min，然后在42℃水浴鍋中進行熱休克20 min，隨后6 000 r/min、4℃離心30 s。用移液器吸除轉化混合液，將沉淀重新懸浮于0.4 mL無菌純水中，輕輕吹吸混勻，取200 μL菌液涂布于SC-URA固體培養基上，于30℃恒溫培養12-16 h，若在SC-URA固體培養基上長出菌落，則表明重組質粒已成功轉化，將重組菌株命名為YEA9。挑取YEA9菌株在SC-URA固體培養基上連續培養8代以上，再保存至甘油管。

1.2.1.2GLN1基因轉錄水平差異分析 將YEA9菌株接入含20 g/L半乳糖的SC-URA液體搖瓶中，收集發酵24 h 的細胞，利用Yeast RNAiso Kit提取總RNA，然后利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser將提取的總RNA進行反轉錄合成cDNA。再以cDNA為模板，用SYBR?Premix Ex TaqTMII配置實時定量PCR反應體系，利用定量PCR儀進行實時定量PCR反應。選擇β-actin作為參比基因，以β-actin轉錄水平為1計算GLN1基因的相對轉錄水平。用于β-actin基因定量的引物為P7和P8，用于GLN1定量的引物為P9和P10。定量PCR反應條件為95℃預變性30 s，95℃變性5 s，46℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環。其測量結果如表2所示。

1.2.1.3 谷氨酰胺合成酶酶活的測定及谷氨酰胺含量的測定 用谷氨酰胺合成酶（Glutamine synthetase，GS）活性檢測試劑盒對該酶活進行檢測，稱取OD600為0.5的酵母細胞0.1 g，再加入1 mL提取液進行冰浴勻漿，在8 000 r/min、4℃的條件下離心10 min，取上清進行檢測。

谷氨酰胺的含量用高效液相色譜法［18］來測量，色譜柱Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相50 mmol/ L磷酸二氫鉀∶乙腈=70∶30，流速0.4 mL/min，柱溫45℃，進樣量10 μL，采用215 nm紫外吸收檢測器。

1.2.2 菌株耐受性能及發酵的測定

1.2.2.1 原始菌株耐受性能的測定 先對酵母菌BY4741的糠醛耐受性進行探索，將酵母菌BY4741接入50 mL的YPD液體搖瓶中，待OD600長到0.5時，以1%的接種量分別轉接于150 mL含有0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L的糠醛培養基中，在30℃、150 r/min條件下進行培養，每6 h取樣測量OD600，繪制生長曲線，以確定能抑制原始菌株BY4741生長的糠醛濃度。

1.2.2.2 重組菌株生長及耐受性能的測定 根據1.2.2.1中所確定的糠醛濃度，對重組酵母YEA9進行耐受性能評估，將菌株YEA9和菌株BY4741分別進行搖瓶培養，再將兩瓶的OD600均調到0.5，從兩瓶中分別取1.5 mL置于含糠醛的150 mL液體培養基中，在30℃、150 r/min條件下進行培養，每12 h取樣測量OD600、葡萄糖含量和乙醇含量，繪制細胞的生長曲線、糖耗曲線以及乙醇生產曲線。

1.2.2.3 發酵產物檢測分析 谷胱甘肽（GSH）的含量用四氧嘧啶法［19］進行測定。取5 mL發酵48 h后的菌液，于8 000 r/min離心3 min后去掉上清液，加入20 mL無菌水重懸并離心，清洗兩次后再加入5 mL的無菌水，于100℃沸水中加熱5 min，隨后置于冰上3 min。細胞懸液經8 000 r/min離心5 min后，取上清液用于測定胞內GSH含量。

使用NADH氧化酶測試盒［20］測定細胞內NADH氧化酶酶活。發酵48 h后取9 mL發酵液，于8 000 r/min離心3 min后收集細胞，用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌2次，根據試劑盒的方法對NADH氧化酶酶活進行測定。

用NAD+/NADH檢測試劑盒測定細胞內的NAD+/NADH水平。取9 mL發酵48 h后的發酵液，于8 000 r/min離心3 min，去掉上清后用PBS洗滌2次，超聲破碎細胞后將懸浮液煮沸5 min，隨后在冰浴中快速冷卻。在離心管中先后加入500 μL的樣品和500 μL 0.2 mol/L NaOH或0.2 mol/L HCl，將混合物于10 000 r/min離心10 min后，收集上清液，測定其NAD+/NADH的含量。

使用探針2’，7’-二氯二氫熒光素二乙酸酯（H2DCFDA）測定2 g/L糠醛條件下重組菌株和對照菌株細胞內ROS水平［21］。取9 mL發酵6 h后的發酵液，將OD600調為0.25，取4.5 mL發酵液，離心收集菌體，用PBS緩沖液洗2遍菌體，然后用500 μL的PBS緩沖液重懸，再加入40 μL H2DCFDA，在黑暗條件下于30℃，200 r/min反應1 h。離心收集細胞，再用PBS洗去多余的熒光染料，用500 μL的PBS緩沖液重懸細胞，吸取200 μL于96孔板中，使用全波長掃描儀，在485 nm激發光和535 nm發射光下測定其熒光強度，并以熒光強度表示胞內ROS的量。

1.2.3 水解液發酵實驗

1.2.3.1 小麥秸稈水解液制備 小麥秸稈取自武漢江夏區農田，除去小麥葉部后粉碎，過40目分樣篩篩成直徑為0.2-0.45 mm的粉末狀樣品以備用［22］。稱取10 g粉碎后的小麥秸稈置于500 mL三角瓶中，按照質量比為1∶10的固液比加入2%的H2SO4于121℃滅菌鍋水解1 h。處理完畢后，經NaOH調節pH至5.0，按酶用量30 FPU/g加入纖維素酶，在45℃下進行酶解，其工藝條件參照相關文獻［23］。水解液制備完成后，檢測其葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和糠醛含量，用于后續纖維乙醇發酵實驗。

1.2.3.2 測量方法 用生物傳感分析儀測量秸稈發酵液中葡萄糖的含量，用高效液相色譜法測量木糖、阿拉伯糖和糠醛的含量。

木糖和阿拉伯糖［24］：色譜柱為Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相4 mmol/LH2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫40℃，示差檢測器。

糠醛［25］：色譜柱Bio-Rad HPX-87H離子交換柱，流動相4 mmol/ L H2SO4，流速0.4 mL /min，柱溫45℃，進樣量10 μL，采用277 nm紫外吸收檢測器。

1.2.3.3 發酵實驗 參照1.2.3.1中所測得的小麥秸稈水解液中葡萄糖、五碳糖和糠醛的濃度，人工模擬水解液，比較BY4741和YEA9的發酵情況，以探究GLN1基因的過表達對釀酒酵母產纖維乙醇的影響。

2 結果

2.1 酵母工程菌YEA9的構建

2.1.1 重組質粒的鑒定 用驗證引物P5、P6對重組質粒進行PCR驗證，并以空載體質粒pESC-URA作為對照，GLN1基因自身長度為1 113 bp。用驗證引物P5、P6經進行PCR，擴增出的片段應為1 264 bp。實驗結果如圖1所示，經瓊脂糖凝膠電泳檢測，擴增片段與預期片段大小基本相符，說明重組質粒構建成功。

圖1 GLN1基因的RCR擴增電泳圖

2.1.2GLN1基因轉錄水平分析及相關產物的測定 在轉錄水平上對菌株進行分析，比較菌株BY4741和YEA9在無抑制物條件下的基因轉錄水平情況，并對胞內谷氨酰胺合成酶酶活以及谷氨酰胺的含量進行測定，每個實驗重復3次，其測量結果如表2所示。

由表2可以看出，在無抑制物的條件下，YEA9的GLN1基因相對轉錄水平比BY4741提高了1.95倍，谷氨酰胺合成酶的酶活提高了17.1%，谷氨酰胺的濃度提高了22.0%，表明GLN1基因的過表達，增強了谷氨酰胺合成酶的酶活，提高了谷氨酰胺的濃度。

表2 測量GLN1相對轉錄水平、谷氨酰胺合成酶酶活以及谷氨酰胺含量的結果

2.2 重組菌株糠醛耐受性能評價

2.2.1 對照菌株BY4741的耐受性實驗 為考察糠醛抑制對照菌株BY4741生長的效果，將BY4741置于含有0.0、0.5、1.0、1.5和2.0 g/L糠醛的YPD培養基中進行培養，測量并繪制細胞的生長曲線，每個實驗重復3次，如圖2所示。

圖2 對照菌株BY4741在不同糠醛濃度下的生長曲線

以上結果表明，隨著糠醛濃度的不斷提升，菌株BY4741的生長受到抑制，高濃度的糠醛不僅抑制了細胞的生長，還降低了細胞在對數生長期的生長速度。當糠醛濃度達到2 g/L時，菌體的生長完全受到抑制，在54 h后，其OD600僅為0.51。我們將菌株BY4741在不同糠醛濃度下的最高OD600繪成曲線，從而選擇具體的糠醛濃度進行后續的耐受性實驗。

如圖3所示，我們將菌株BY4741的最大OD600和與之對應的糠醛濃度進行擬合，計算得出糠醛的IC50（半抑制濃度）為0.76 g/L，IC75（75%抑制濃度）為1.55 g/L。為了篩選出耐受性較強的菌株，我們選擇1.55 g/L的糠醛濃度來探索重組酵母菌YEA9的生長情況。

圖3 對照菌株BY4741在不同糠醛濃度下的最高OD值

2.2.2 BY4741和YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的發酵結果 為探索重組菌株YEA9對糠醛的耐受效果，將BY4741和YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下進行葡萄糖單糖發酵，初始糖濃度為20 g/L，每12 h測量菌體的OD600及搖瓶中乙醇和葡萄糖的含量，每個實驗重復3次，生長情況的結果如圖4所示，乙醇生產情況及葡萄糖消耗情況的結果如圖5所示。

在菌株生長方面，BY4741菌株和YEA9菌株能達到的最大OD600值分別為0.74和2.74，即在1.55g/L糠醛濃度下，YEA9的生物量較BY4741提高了3.7倍（圖4）。在利用葡萄糖方面，BY4741的平均耗糖率為0.024 g/（L·h），而YEA9的平均耗糖率為0.207 g/（L·h），較BY4741提高了8.6倍；在產乙醇方面，BY4741最終乙醇濃度為0.943 g/L，而YEA9最終乙醇濃度為8.64g/L，較BY4741提高了9.2倍，且BY4741的糖醇轉化率為80.2%，YEA9的糖醇轉化率為88.7%，較BY4741提高了10.6%；在發酵周期方面，YEA9在84 h發酵結束，而BY4741的葡萄糖并未耗完，殘糖量為88.5%（圖5）。

圖4 BY4741與YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的生長曲線

圖5 BY4741與YEA9在1.55 g/L糠醛濃度下的乙醇生產及糖耗曲線

2.2.3 菌株發酵產物的測定

2.2.3.1 谷胱甘肽抗氧化系統的檢測 按照1.2.2.3中的測量方法，分別測量BY4741和YEA9中的谷胱甘肽含量、NADH氧化酶酶活以及NAD+/ NADH，每個實驗重復3次，其測量結果見表3。由表3可知：YEA9的谷胱甘肽含量較BY4741提高了22.4%，NADH氧化酶酶活提高了5.1%，但是NAD+/NADH的數值沒有明顯變化，說明GLN1基因的過表達有助于谷胱甘肽的合成，能增強NADH氧化酶的酶活，不改變胞內還原力的平衡。

表3 測量谷胱甘肽含量、NADH氧化酶酶活以及NAD+/NADH的結果

2.2.3.2 胞內活性氧自由基檢測 由于糠醛能誘導酵母細胞內活性氧（ROS）的積累，為進一步探索GLN1基因的過表達與ROS含量的關系，對BY4741和YEA9的胞內活性氧自由基進行檢測，每個實驗重復3次，檢測結果如圖6所示。

圖6 BY4741和YEA9的ROS水平測定

通過測量過表達前后兩菌株的ROS含量，發現重組酵母YEA9的ROS水平較釀酒酵母BY4741降低了32.26%，計算得P值小于0.01，說明該兩組數據是有極顯著差異性的，表明過表達GLN1基因可以降低胞內的ROS水平，從而減少ROS對細胞的傷害。

2.3 小麥秸稈水解液糖濃度檢測結果

2.3.1 小麥秸稈水解液含量的測定 對小麥秸稈水解液中葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和糠醛的濃度進行檢測，每個實驗重復3次。

根據檢測結果可知，葡萄糖濃度為47.8 g/L，木糖濃度為23.1 g/L，阿拉伯糖濃度為3.0 g/L、糠醛濃度為1.1 g/L，根據此數值模擬水解液，將模擬水解液的培養基定為：蛋白胨20 g/L，酵母粉10 g/L，葡萄糖47.8 g/L，糠醛濃度為1.1 g/L。

2.3.2 重組菌株在水解液中的生長情況 為探索重組菌株YEA9在水解液中的耐受情況，將BY4741和YEA9在模擬水解液中進行發酵，每12 h測量菌體的OD600及搖瓶中乙醇和葡萄糖的含量，每個實驗重復3次，生長情況的結果如圖7所示，乙醇生產情況及糖耗情況的結果，如圖8所示。

在菌株生長方面，BY4741菌株和YEA9菌株能達到的最大OD600值分別為2.04和6.07，即在模擬水解液中，重組菌株YEA9的生物量較BY4741提高了2.98倍（圖7）。在利用葡萄糖方面，BY4741的平均耗糖率為0.13 g/（L·h），而YEA9的平均耗糖率為0.79 g/（L·h），較BY4741提高了6.1倍；在產乙醇方面，BY4741最終乙醇濃度為3.9g/L，而YEA9最終乙醇濃度為20.5 g/L，較BY4741提高了5.3倍，且BY4741的糖醇轉化率為84.4%；YEA9的糖醇轉化率為84.8%，較BY4741提高了0.5%；在發酵周期方面，YEA9在60 h發酵結束，而BY4741的葡萄糖并未耗完，其殘糖量為81.2%（圖8）。

圖7 BY4741與YEA9在模擬水解液下的生長曲線

3 討論

對比釀酒酵母YEA9和BY4741的發酵情況，我們可以看出，無論是在1.55 g/L的糠醛培養基中，還是在模擬水解液中，YEA9的生長量、葡萄糖消耗速率、最終乙醇濃度以及糖醇轉化率都比BY4741高，表明YEA9有更強的抗糠醛脅迫能力，更有利于纖維乙醇的生產。過表達GLN1基因后，釀酒酵母中的谷胱甘肽含量有所提高，NADH氧化酶的酶活也得到了增強，表明胞內的谷胱甘肽抗氧化系統水平提升了，從而降低了胞內ROS的積累，避免了由于糠醛產生的ROS對細胞線粒體和液泡膜的損害，進而提高了釀酒酵母的糠醛耐受性。

圖8 BY4741與YEA9在模擬水解液下的乙醇生產及糖耗曲線

方青［26］在釀酒酵母中過表達了編碼谷胱甘肽依賴的氧化還原酶基因GRX5，使得谷胱甘肽過氧化物酶的活性提高了158%，且重組菌株在糠醛濃度為0.5 g/L的模擬玉米秸稈水解液中，其糖醇轉化率為81%。而在本實驗中，重組菌株YEA9在糠醛濃度為1.1 g/L的模擬小麥秸稈水解液中的糖醇轉化率達到了85%，表明YEA9在高濃度糠醛存在的條件下，其糖醇轉化率依然很高。Wang等［27］通過過表達脯氨酸和甾醇代謝途徑的關鍵基因PRO1和INO1，在0.8 g/L糠醛脅迫的條件下，重組菌株的糖耗速率為0.36 g/（L·h），乙醇產率為0.17 g/（L·h），而本實驗通過過表達谷氨酰胺合成酶基因GLN1，使得該菌在1.1 g/L糠醛脅迫下，其糖耗速率為0.79 g/（L·h），乙醇產率為0.43 g/（L·h），通過對比可以看出，重組菌株YEA9在生產乙醇方面具有更好的優越性。

綜上，重組菌株YEA9可以在較高濃度的糠醛脅迫下產生更多的乙醇，并能降低胞內ROS水平，利用基因工程的方法來增強胞內的代謝通路，為探索機理提供更多的途徑。然而在纖維乙醇的生產過程中，釀酒酵母在水解液中的生長不僅受到糠醛的抑制，還會受到弱酸及酚類的抑制作用，我們可以通過基因工程的手段對釀酒酵母進行進一步的改造，從而增加釀酒酵母對多種抑制物的耐受能力。

4 結論

本研究以原始酵母菌BY4741為出發菌株，通過過表達GLN1基因，成功構建了重組菌株YEA9，該菌的糠醛耐受性較原始菌株得到了提升，最終乙醇產量也有所提高，并發現GLN1基因的過表達能降低胞內ROS水平，從而提高胞內的抗氧化能力，以此來增強其對糠醛的耐受性。