凡納濱對蝦黑鰓病病原的分離鑒定及耐藥性分析

林嘉銘 葛輝， 林克冰楊章武 周宸吳建紹 王國棟 張哲

楊求華2王藝磊1

（1. 集美大學水產學院 農業農村部東海海水健康養殖重點實驗室，廈門 361021；2. 福建水產研究所 福建省海洋生物增養殖與高值化利用重點實驗室，廈門 361000）

凡納濱對蝦（Litopenaeus vannamei），屬節肢動物門（Arthropoda）、甲殼綱（Crustacea）、十足目（Decapoda）、游泳亞目（Natantia）、對蝦科（Penaeidae）及對蝦屬（Penaeus），濱對蝦亞屬（Litopenaeus）［1］，是全世界養殖產量最高的蝦種。凡納濱對蝦因具有生長速度快、育苗時間短、抗病能力強、營養需求低、適應養殖環境能力強和方便運輸等優點，自1988年引進我國后，迅速成為我國養殖面積最大、產量最高的蝦類［2］。然而隨著養殖規模的不斷擴大和集約化程度的不斷提高，凡納濱對蝦的暴發性疾病也隨之而來，給中國乃至全球對蝦養殖業帶來了巨大的損失［3］。截至目前學者們已經發現眾多蝦類疾病，病原主要是病毒、細菌和真菌［4-5］。

日本的石川雄介于1968年在日本對蝦（Penaeus japonicus，現命名為日本囊對蝦Marsupenaeus japonicus）病蝦上首次發現了鐮刀菌，因可致患病的蝦鰓絲變黑而命名為黑鰓病［6］。在凡納濱對蝦、加州對蝦（P. californiensis）、中國明對蝦（Fenneropenaeus chinensis）、長毛明對蝦（F. penicillatus）、斑節對蝦（P.monodon）等對蝦中已被證實為致病菌［7-10］。鐮刀菌在凡納濱對蝦上的傳播途徑一般是鐮刀菌分生孢子或厚膜孢子侵入后，寄生在鰓、頭胸甲、附肢、體壁和眼球等處的組織內萌發成菌絲，并有黑色素沉淀而呈黑色。親蝦感染鐮刀菌后，活力降低，性腺發育緩慢，鰓組織、甲殼等病灶部位黑化壞死。其中引起蝦死亡的主要原因是破壞鰓的呼吸功能，導致對蝦呼吸衰竭死亡［11］；鐮刀菌還可生成真菌毒素，使宿主中毒。

目前大部分的蝦類養殖模式還是以粗放型高密度為主，會引起養殖環境和各種水化因子的惡化，給病原的快速傳播提供條件。國內對凡納濱對蝦病害的研究多集中在病毒性和細菌性病害，對該養殖品種真菌性病害的研究報道較少。本研究從福建晉江育苗場的患黑斑病的凡納濱對蝦體內分離分離出了真菌，并進行了病原菌的分離鑒定、致病性、耐藥性的檢測，旨在查明凡納濱對蝦黑斑病的病原菌及其致病力，結合藥敏分析結果，以期為該病的有效防控提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 患病對蝦 對蝦樣品取自晉江廈興龍育苗場越冬廈興龍1號凡納濱對蝦親蝦（約50 g/尾）。病蝦癥狀為鰓瓣呈褐色或黑色斑，體表和附肢亦出現黑褐色斑點潰瘍，取下發病部位，鏡檢可發現有真菌菌絲或分生孢子。

1.1.2 試劑 馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養基購于北京陸橋技術股份有限公司。沙堡培養基自配（準確稱取蛋白胨10.0 g，葡萄糖40.0 g，瓊脂20.0 g，蒸餾水1 000.0 mL，加熱煮沸至完全溶解后115℃滅菌30 min）。基因組DNA提取檢測試劑盒、PCR相關試劑購自天根生物科技有限公司。

兩性霉素B、那他霉素、制霉菌素、伊曲康唑、氟康唑、酮康唑、克霉唑、5-氟胞嘧啶購自麥克林公司，咪康唑、益康唑購自安耐吉公司，特比萘芬購自阿拉丁公司。二甲基亞砜（DMSO）購自上海新睿生物科技有限公司。11種藥物純度為98%-100%。依據M38-A2方案配制上述藥物的儲存液，其中水溶性藥物氟康唑溶于無菌蒸餾水，其他脂溶性藥物溶于DMSO。每一批儲存液均設溶劑對照。各藥物的工作液濃度范圍：克霉唑、益康唑、特比萘芬、咪康唑、兩性霉素B、氟康唑、伊曲康唑為0.031 3-16 μg/mL；那他霉素、0.061 3-32 μg/mL；制霉菌素、酮康唑、5-氟胞嘧啶為0.125-64 μg/mL。

1.2 方法

1.2.1 病原菌分離及形態觀察 在無菌條件下，用酒精棉球擦拭病蝦體表后解剖，從患病部位取樣，分別在PDA培養基平板（pH7）上劃線培養，28℃恒溫培養48 h，觀察菌落的顏色、形狀及菌絲疏密程度。然后挑取少量菌絲于顯微鏡下，觀察大分生孢子和小分生孢子的形狀、隔膜數量及厚膜孢子的有無、形態，并拍照記錄。根據菌落特征的不同，挑取單菌落劃線分離，數次傳代后將純化的菌株編號保存備用。

1.2.2 真菌DNA 提取及ITS-rDNA的PCR 擴增 菌株基因組的提取 以分離純化培養后的病原菌為原料，采取煮沸法獲取真菌的基因組。挑取真菌的菌絲于無菌水中，重懸后金屬浴100℃，10 min，然后冰浴 20 min，12 000 g/min 離心2 min，取上清液于-20℃保存，作為 PCR 擴增模板。

采用真菌通用引物ITS1（5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'TCITS4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'TCCTPCR擴增。25 μL PCR反應體系為：模板DNA 1 μL，引物（0.4 μmol/L）各1 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O補足至25 μL。PCR擴增條件：94℃預變性5 min；94℃變性1 min，54.5℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環；72℃延伸10 min。擴增產物用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。經觀察并拍照、割膠回收、連接轉化后，挑取陽性克隆進行序列測定。

1.2.3 克隆測序及系統發育樹構建 測序由英濰捷基生物技術有限公司完成。將所得到的菌株ITSrDNA序列提交至GenBank獲得序列號，并在NCBI的GenBank數據庫中進行BLAST比對和同源性分析，運用MEGA 6.0軟件中的N-J法構建系統發育樹。

1.2.4 人工感染實驗 取健康凡納濱對蝦于室內水族箱中暫養一周，期間水溫為（25±1）℃，放養密度為10尾/缸。將分離后的菌株接種于PDA瓊脂平板上，28℃培養7-10 d 使其產生大量真菌孢子［12］，取5 mL的對蝦生理鹽水［13］加入平板，用一次性無菌吸管輕輕抽吸后，將有孢子和菌絲片斷的菌懸液吸到尖端開口并帶濾紙的EP 管后滲漏至另一無菌EP 管［14］，使用血球計數板調整菌懸液的濃度為1×108CFU/mL，并將菌懸液梯度稀釋至5.0×104CFU/mL（F1組），5.0×105CFU/mL（F2組），5.0×106CFU/mL（F3組）。隨機選取凡納濱對蝦10尾通過腹足基部注射方式進行人工感染試驗，每組取3個平行。按照25 μL/尾［（20±3）g］腹足基部注射菌液，同時設立注射等比例生理鹽水的對照組（C組），注射后移至新鮮海水中暫養后觀察癥狀。分別于腹足基部注射后0 h、12 h、1 d、2 d、3 d、4 d、5 d、6 d、7 d和8 d觀察并記錄死亡情況及病理癥狀。取具有自然發病癥狀（黑鰓病癥）的人工感染蝦，在無菌條件下進行病原菌再分離培養，并比較分離得到的病原菌和攻毒所用的病原菌的各項特征，若為同種病原菌則說明攻毒用的菌與原患病親蝦體內的病原菌與為同一病原菌。

1.2.5 藥物敏感性分析 藥物敏感性試驗按瓊脂稀釋法和常量液基稀釋法進行，測定最小抑菌濃度，參照NCCLS的M38-A2方案測定藥物的最小抑菌濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）［15］。質控菌株選用克柔念珠球菌。

1.2.5.1 藥液的制備 氟康唑和5-氟胞嘧啶等水溶性藥以滅菌蒸餾水溶解；酮康唑、伊曲康唑、兩性霉素B、伏力康唑等均用二甲亞砜溶解。兩性霉素B、伊曲康唑、特比萘芬制成3.2 mg/mL 的儲備液，那他霉素制成6.4 mg/mL 的儲備液，放-20℃備用。

1.2.5.2 真菌菌懸液制備 同1.2.4方法制備菌懸液，以RPMI1640 培養基將菌液稀釋至5.0×103CFU/mL。取部分菌懸液用生理鹽水稀釋100 倍，吸取100 μL調好的接種液接種至沙堡氏葡萄糖瓊脂平板上，將平板于28℃下孵育并每日觀察有無菌落形成。

1.2.5.3 藥敏平板制備 將配置好濃度梯度的藥物取出，各取8 mL于提前配制的沙堡瓊脂培養基（72 mL）中，混合均勻后倒入4個平板備用。藥物平板中接種測試菌液，每點接種2.5 μL，可進行多點接種。并設置生長對照和空白對照，28℃培養48 h。以確認生長對照平板菌生長良好，空白對照平板無污染菌生長。逐一觀察從高濃度至低濃度藥物平板上的生長情況，并拍照記錄。

1.2.5.4 藥敏試管制備 在無菌的15 mm×100 mm試管編號1-10中依次加入0.1 mL倍比稀釋的不同濃度藥物工作液。依次在試管中加入已配置好的菌懸液工作液0.9 mL，混勻。整個過程均在15 min內完成。在設置空白對照和生長對照的同時進行質控菌株的平行試驗，進行質量控制。將試管置于28℃培養48 h觀察結果。肉眼觀察對照試管混濁（+，有細菌顯著生長），判定澄清（-，無肉眼可見菌生長）。

2 結果

2.1 病癥觀察及鏡檢

患病親蝦的主要癥狀為鰓絲黑斑，頭胸部甲殼、腹部甲殼邊緣、游泳足基部和尾扇邊緣等多處出現大小不一的焦黑狀斑塊，部分斑塊穿孔，如圖1-A圓圈所示。取病灶部位鰓絲，在顯微鏡下可觀察到菌絲（圖1-B箭頭所示）和孢子（圖1-C圓圈所示）。

圖1 患病對蝦

2.2 真菌的培養特性和形態特征

通過分離純化方法獲得了1株純化菌株。該菌株在PDA培養基上28℃培養3 d可見正面觀察為白色羊絨狀的圓形菌落，中央濃密，外圍稀疏（圖2-A）。背面觀察為中央淡黃色，邊緣白色（圖2-B）。

顯微鏡下可觀察到透明菌絲（圖3-A，箭頭所示），分支，有隔膜和大量內容物，菌絲易纏繞。可見分生孢子，小型分生孢子呈橢圓形或卵圓形（圖3-A，圓圈所示）；大型分生孢子呈鐮刀形，稍彎，有多個隔膜（圖3-B，圓圈所示）。

圖 2 真菌菌落形態

圖3 真菌菌絲及分生孢子

2.3 人工感染實驗

從上述分離的病原菌，通過腹足基部注射的方式進行人工感染實驗。經8 d的實驗觀察，注射孢子懸液的實驗結果表明，分離菌株對凡納濱對蝦有致病力，人工感染后出現與自然發病對蝦相似的癥狀：出現黑鰓癥狀（圖4-A 圓圈所示），取鰓絲鏡檢可觀察到鰓絲上有大量菌絲（圖4-C箭頭所示），而對照組正常（圖4-B，圖4-D）。在人工感染實驗中受試蝦的7 d致死率為F1組80.00%，F2組53.33%，F3組0.00%（表1，圖5）。另外，從人工感染發病的蝦體中重新分離到的菌株，經分子鑒定表明其與人工感染菌株一致。

表 1 真菌對健康凡納濱對蝦的人工感染試驗結果

2.4 真菌ITS-rDNA鑒定結果

對純化后的真菌提取DNA，利用真菌通用引物ITS1和ITS4進行擴增，在550 bp附近有明顯的擴增條帶。將PCR產物送至英濰捷基生物技術有限公司測序。

圖 4 感染真菌組與對照組凡納濱對蝦

圖5 注射不同濃度真菌后凡納濱對蝦存活率-時間曲線

測序后，將所得ITS-rDNA序列（ITS-1）在NCBI數據庫中進行Nucleotide BLAST 比對，發現該序列和腐皮鐮刀菌的序列（Fusariumsolani，KX783367.1）的相似性達99%以上，可將本研究獲得的對蝦黑斑病的病原鑒定為腐皮鐮刀菌。

將病原菌的ITS-rDNA序列與腐皮鐮刀菌、其他部分鐮刀菌種序列一起用MEGA6.0軟件構建系統進化樹（圖6）。結果發現：病原真菌的序列ITS-1在系統進化樹上與腐皮鐮刀菌聚在同一分枝中，這與前期形態鑒定和序列比對的結果是一致的，進一步證實了該菌為腐皮鐮刀菌。

2.5 藥敏試驗結果

2.5.1 藥物的初步篩選 初步篩選采用測試濃度范圍的最高濃度以瓊脂稀釋法進行檢驗（圖7），通過與生長對照組進行對比，發現鐮刀真菌在含有克霉唑（16 μg/mL）、益康唑（16 μg/mL）、特比萘芬（16 μg/mL）、制霉菌素（64 μg/mL）、那他霉素（32 μg/mL）、酮康唑（64 μg/mL）的平板中，肉眼觀察均未有菌落生長；在含有咪康唑（16 μg/mL）、伊曲康唑（16 μg/mL）、5-氟胞嘧啶（32 μg/mL）、兩性霉素B（16 μg/mL）、氟康唑（16 μg/mL）的平板中均觀察到有菌落生長。故選用克霉唑、益康唑、特比萘芬、制霉菌素、那他霉素和酮康唑進行后續實驗。

2.5.2 藥敏結果 瓊脂稀釋法及常量稀釋法結果對比（表2）：二者結果一致，且各藥物的最小抑菌濃度分別為：克霉唑8 μg/mL，益康唑1 μg/mL，特比萘芬4 μg/mL，制霉菌素64 μg/mL，那他霉素8 μg/mL，酮康唑64 μg/mL，其中益康唑、特比萘芬的瓊脂稀釋法藥敏結果分別如圖8和圖9所示。

圖6 本實驗所分離鐮刀真菌ITS-rDNA基因序列系統發育樹

圖7 藥物的初步篩選結果

表2 藥敏結果

圖8 益康唑藥敏結果

3 討論

圖9 特比萘芬藥敏結果

鐮刀菌的菌屬可以利用傳統的形態學方法進行鑒定［16］，然而鐮刀菌的表觀形態特征容易受到各種因素的影響，因此，單憑傳統的形態學方法來進行分類鑒定常出現誤差，不能精準的區分鐮刀菌屬，尤其是區分一些形態相近的姊妹種和復合種，從而影響后續工作的開展。目前，常用的鑒定病原體的方法之一是分子生物學技術［17］，該技術可以避免傳統方法培養技術缺陷，為鐮刀菌鑒定提供了更加科學的技術手段。常用的分子手段有主效位點基因rDNA-ITS［18-19］、EF1-ɑF1-IN NESSR、ISSR等分子標記技術［19-21］。本研究對蝦體病變部位進行病原體的分離純化，分離出了明顯優勢菌，通過形態學特征，結合分子生物學技術rDNA-ITS基于ITS序列的系統發育分析［17］，確定了引起親蝦黑鰓病的病原菌為腐皮鐮刀菌。

在凡納濱對蝦黑鰓病中，由不同病原菌引發類似病癥的“一癥多病”現象廣泛存在。弧菌、絲狀細菌、鐮刀菌、鏈壺菌、地霉、水霉、聚縮蟲和擬阿腦蟲等都能導致對蝦患黑鰓病［22-23］。因此，在生產一線中僅憑經驗進行疾病的現場診治效果往往存在很大偏差，必須通過實驗室確診后方可有針對性地制定相應措施對疾病進行防治。

由于腐皮鑲刀菌分布的廣泛性，我國幾種主要養殖蝦類均為其適宜寄主，造成了養殖對蝦黑鰓病十分普遍。人工感染腐皮鐮刀真菌分生孢子根據注射濃度的不同引起對蝦的死亡率也有所不同，在本實驗中，設置了3個濃度梯度的菌懸液對凡納濱對蝦進行人工感染實驗，人工感染實驗結果顯示，使用5.0×104CFU/mL濃度的菌懸液對凡納濱對蝦的8 d的存活率為73.33%，使用5.0×105CFU/mL濃度的菌懸液的存活率為40.00%，使用5.0×106CFU/mL濃度的菌懸液的存活率為0%，結果與Goncalves［24］和陳波等［7］的研究結果類似。

抗真菌藥物敏感實驗能夠指導抗真菌藥物的選擇，從1992年起，雖然美國的NCCLS制訂了一系列針對抗真菌藥物敏感實驗的指導性文件，但仍未能適用于所有真菌的檢測。目前抗真菌藥物敏感實驗方法多樣化，主要分為藥基法和菌基法（瓊脂擴散法）。藥基法又分為瓊脂稀釋法、常量液基稀釋法、微量液基稀釋法；菌基法又分為ROSCO抗真菌藥敏紙片法、E試驗法等。而鐮刀菌屬絲狀真菌，由于絲狀真菌生長較慢，體積較大，給絲狀真菌的藥物敏感試驗帶來很多困難。迄今為止，針對絲狀真菌的藥物敏感試驗無論是在選擇培養基、確定接種菌濃度還是對重點的判定上，仍未確定標準化的藥敏試驗方法［15］。因此，試驗中采用的是瓊脂稀釋法以及參照NCCLS的M38-A后使用的常量液基稀釋法對分離的腐皮鐮刀真菌進行藥物敏感性實驗，以確定腐皮鐮刀真菌的MIC。

本研究的MIC結果顯示，在所用11種藥物中，該菌株對益康唑的敏感性最高，對克霉唑、特比萘芬、那他霉素也具有較好的效果，特比萘芬、那他霉素的結果與Walther等［25］和劉立春［26］的結果一致；對咪康唑和廣譜抗真菌藥物伊曲康唑沒有表現出較高的敏感性，與Lalitha等［27］的研究一致；其他藥物抑制作用較差。

4 結論

從福建晉江育苗場的患有黑鰓病的越冬親蝦中分離鑒定到一株腐皮鐮刀真菌，對其進行研究顯示，了該菌株對凡納濱對蝦有較強的致病力，藥物敏感試驗表明該菌株對克霉唑、益康唑、特比萘芬和那他霉素等4種藥物敏感。綜上，可將益康唑和特比萘芬、克霉唑、那他霉素考慮作為可供選擇的藥物。當然，具體的使用應在結合藥物敏感性實驗結果的同時還需要考慮養殖對蝦的耐受情況，以期有效預防治療和控制鐮刀真菌的感染。