植物高親和鉀離子轉運蛋白HAK功能研究進展

蘇文 劉敬 王冰 李魏 戴良英

（湖南農業大學植物保護學院 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，長沙 410128）

K+是植物體內含量最豐富的陽離子，同時鉀也是作物生長必需的三大礦質營養元素之一，約占植物干重的 2%-10%［1］。與氮、磷兩種元素不同，雖然鉀不參與任何有機物質的合成，卻在植物生長發育過程中起著不可替代的作用，其主要參與植物體內許多重要的生理和生化過程，如（1）促進植物脂肪代謝、水分代謝；（2）促進同化物轉化，促進韌皮部的養分運輸；（3）控制細胞膜極化；（4）調節氣孔運動，促進光合作用；（5）作為酶的激活劑；（6）維持陰陽離子平衡；（7）調節滲透壓等［2-5］。同時鉀還可以提高植物對高鹽、干旱等非生物脅迫及病蟲害的耐受性，缺鉀會直接影響植物的生長發育，如加速老葉黃化，根系短小且易倒伏等［3］。土壤中所能提供的速效鉀的含量很少，約在10-100 μmol/L之間，且土壤內有效鉀離子濃度變化巨大，有時相差100倍左右，為了適應不同的鉀濃度環境，滿足自身對鉀營養的需求，保持體內穩態，植物細胞分化出高親和與低親和兩種鉀吸收系統［6］。在外界鉀營養匱乏的環境下，植物細胞主要采用高親和鉀吸收系統來進行鉀的吸收和轉運［5，7］。本文主要介紹了高親和鉀吸收系統中KUP/HAK/KT家族的基本情況及其分類、高親和鉀離子轉運蛋白HAK的系統發育分析及其在植物鉀吸收，生長發育，抵抗生物脅迫和非生物脅迫等方面的功能。深入了解鉀離子轉運蛋白HAK在植物體內的吸收及作用機制對于有效提高鉀肥的利用效率，提升作物產量與品質，促進農業發展等方面具有重要的現實意義。

1 鉀離子轉運載體KUP/HAK/KT家族簡介

K+在土壤中的流動性較低，大部分被土壤吸附或固定，因此植物根系所能利用的鉀濃度很低。在低鉀環境（鉀濃度低于0.2 mmol/L）下，植物的根系細胞膜進化出高親和鉀轉運蛋白從土壤溶液中進行鉀的有效吸收與轉運，以滿足自身對鉀的高營養需求［8-9］。根據高親和K+轉運蛋白的序列特征和結構不同，其主要分為4大家族：KUP（K+uptake）/HAK（High-affinity K+）/KT（K+transporter）家 族、HKT/Trk/Ktr家族、CHX（Cation/hydrogen exchanger）家 族 以 及KEA（K+efflux anti-porter）家 族［10-11］。KUP/HAK/KT家族是植物體內高親和K+轉運家族中最大、成員最多的家族，該家族成員廣泛存在于植物的各組織器官中，在細胞膜和液泡膜上行使功能，其成員已在植物、真菌及變形蟲中均有發現，但尚未涉及原生生物和動物界［12］。研究發現水稻（Oryza sativaL.）中存在27個潛在的KUP/HAK/KT家族的轉運蛋白，在擬南芥（Arabidopsis thaliana）、玉米（Zea maysL.）、白楊（Populus tomentosaCarr）和番茄（Solanum lycopersicum）中分別存在13、27、31和21個［10，13-14］。

植物KUP/HAK/KT家族基因基于系統發育關系，保守基序和基因結構分析分為4個主要的系統發育亞族［15］。第I亞族在低鉀環境下表達上調，該家族基因編碼的轉運蛋白均能介導高親和力鉀吸收，也有部分I亞族基因可以為低親和的鈉內流提供通道，如HvHAK1和PhaHAK1等［9，16-17］。第II亞 族 參 與了植物的生長發育進程，其成員在序列和功能上具有很大的差異，該亞族轉運蛋白可介導鉀的高親和與低親和攝取［16，18］。部分II亞族成員調控了植物的生長進程，如AtKUP4/TRH1突變會導致擬南芥生長素轉運受損、根毛細小；AtKUP2（shy3-1）突變會降低芽細胞擴增等［19-20］。目前，對KUP/HAK/KT第 III及第IV亞族轉運蛋白生理功能的研究還相對較少［13］。

2 植物鉀離子轉運蛋白HAK簡介及系統發育分析

植物HAK鉀轉運蛋白在介導高親和K+吸收和轉運過程中發揮著關鍵作用，其轉運過程介導H+/K+的同向運輸，屬于逆化學勢梯度，消耗能量的主動運輸過程。編碼高親和力K+轉運的HAK蛋白在大麥（Hordeum vulgareL.）中首次被克隆出來，后在其他植物中又陸續發現了多個HAK蛋白［21］。在結構方面，HAK鉀轉運蛋白通常具有12個跨膜區域（Transmembrane segments，TMS），在第2個和第3個TMS之間存在著胞質Loop，C末端和N末端均位于胞內側［22］（圖1）。由于HAK高親和鉀轉運蛋白在瓜蟾卵母細胞中不表達，但可補充存在K+吸收缺陷的酵母（Saccharomyce）或細菌突變體中的K+吸收。因此，該蛋白的功能常在酵母和大腸桿菌等異源系統中進行驗證［23-24］。

圖1 植物HAK高親和鉀轉運蛋白結構示意圖

為了研究植物中HAK轉運蛋白之間的進化模式和系統發育關系，用MEGA將水稻、擬南芥、玉米、大麥和煙草（Nicotiana tabacumL. /Nicotiana rustica）等13個物種的69個HAK蛋白的氨基酸序列完全比對，通過NJ（Neighbor-Joining，NJ）方法構建了一個綜合的系統發育樹（圖2）。從系統發育樹中，我們發現植物中該轉運蛋白的所有成員都被分為7組（A-G），A組包括來自煙草、非洲冰草（Mesembryanthemum crystallinum）、水稻、玉米、海草（Cymodocea nodosa）和蘆葦（Phragmites australisTrinius）中的16個基因；B組包括來自水稻、玉米、海草、大麥4個物種中的8個基因；C組包括水稻、玉米中的6個基因；D組包括水稻、玉米、桃（Physcomitrella patens）和蘆葦中的9個基因；E組同樣包括水稻和玉米中的6個基因；F中包括辣椒（Capsicum chinense）、番茄、擬南芥（Arabidopsis thaliana）、鹽 芥（Thellungiella halophila）和 蓖 麻（Ricinus communis）中的5個基因；G組中包括水稻、玉米、蘆葦、大麥4個物種中19個基因。該系統發育樹中的所有基因都起源于種子植物，表明其可能獨立地在種子植物中形成，其中B、C、E和F組均是單子葉植物的基因，其他組既包括單子葉植物的基因，也包括雙子葉植物的基因。

3 高親和鉀離子轉運蛋白HAK的功能

3.1 促進植物鉀吸收

圖2 植物HAK高親和鉀轉運蛋白的系統發育樹

鉀在植物生長發育過程中發揮著不可替代的作用。低鉀環境下水稻根和芽中的眾多HAK基因均被誘導表達。研究發現OsHAK1在低鉀和高鉀的酵母環境中均生長良好，OsHAK1被敲除后植株的鉀吸收率及轉運能力與野生型相比均顯著降低，而過表達植株則增強了水稻中鉀的積累，這表明OsHAK1是一種能同時介導水稻高親和與低親和K+攝取的轉運蛋白［13］。OsHAK5能在僅含0.1mmol/L K+的酵母環境中生長，水稻敲除OsHAK5后，其根系凈鉀流入速率和地上部分的鉀轉運能力受到嚴重影響，相反，過表達OsHAK5植株的鉀積累量則顯著增加［9，25］。水 稻OsHAK16在K+不 足 時 表 達 上 調，OsHAK16被敲除后顯著降低了水稻根系凈鉀吸收速率和生長狀態，而過表達OsHAK16僅在0.1 mmol/L K+水平上改善了植物總鉀吸收含量及生長狀態［26］。OsHAK7、OsHAK10在酵母及細菌突變體中均被驗證可介導低親和鉀吸收［27］。當在K+缺陷型酵母中表達時，OsHAK21發揮鉀積累功能，彌補了其生長缺陷［28］。這些證據證明HAK轉運蛋白在維持水稻K+穩態方面起著至關重要的作用。

AtHAK5是擬南芥面對缺鉀脅迫時反應的標志基因，在K+饑餓時，擬南芥根中的AtHAK5轉錄水平增加，T-DNA插入后植株的鉀積累量減少，該基因的同源物LeHAK5、ThHAK5、HvHAK1、CaHAK1和OsHAK1均對K+不足有響應［5，29-30］。通過酵母實驗發現，辣椒（Capsicum annuumL.）CaHAK1能介導植株高親和力K+攝取［31］。雖然番茄LeHAK5不能彌補酵母突變體WD3在0.1 mmol/L 鉀環境下的生長缺陷，但是LeHAK5-CaHAK1復合體卻能補充這種缺陷［32］。從缺鉀植株根系中分離得到的鹽芥ThHAK5能在0.1 mmol/L K+的酵母環境中生長，介導植物的鉀吸收［33］。低鉀環境下大麥HvHAK1的轉錄水平相比于正常鉀環境增加了5倍，將大麥HvHAK1cDNA插入酵母表達載體中發現，HvHAK1能介導酵母在0.1 mmol/L 的K+環境中生長［34］。HvHAK4可能有助于大麥吸收K+至生長中的葉片組織中，并維持葉肉K+濃度高于表皮［35］。研究發現，非洲冰草中McHAK1、McHAK2、McHAK4可恢復鉀攝取缺陷型酵母菌株在毫摩鉀環境下的生長，促進植物鉀吸收［36］。獐茅（Aeluropus littoralis）中AlHAK轉運蛋白可介導植物的高親和性鉀吸收［37］。蘆葦植物中PhaHAK2和PhaHAK5均為高親和鉀轉運蛋白，介導植物鉀營養積累［17，38］。海草中CnHAK1過表達后介導了大腸桿菌突變體中的快速K+涌入，這些涌入的濃度依賴性證明CnHAK1為低親和力K+轉運蛋白［39］。煙草NrHAK1在面臨低鉀脅迫時表達上調，在低鉀環境下能增加植株鉀離子含量的積累［40］。低鉀處理提高了桑椹（Morus albaL.）MaHAK5的轉錄水平［41］。

研究發現，谷子（Setaria italica）SiHAK1在低鉀環境下表達上調顯著，促進植物鉀吸收，SiHAK2則在K+濃度較高時增加鉀營養的積累，通過在酵母中添加不同的鉀濃度比較SiHAK1與OsHAK1、OsHAK5和HvHAK1的鉀轉運能力，發現SiHAK1與其他3種鉀運蛋白相比更能適應低鉀環境，這些結論證明SiHAK1是一種在低鉀環境下進行K+轉運的高親和轉運蛋白，且具有更好的鉀轉運能力［42］。玉米ZmHAK5是一種高親和的鉀轉運蛋白，ZmHAK5突變植株鉀吸收能力降低，相反，超表達ZmHAK5后則表現出更好的生長狀態及鉀吸收能力。ZmHAK1在低鉀條件下同樣表達上調，但其鉀轉運能力不及ZmHAK5［43］。在甘蔗（Saccharum officinarum）中研究發現，SsHAK1和SsHAK21均具有鉀轉運活性，可恢復酵母突變菌株的鉀離子吸收功能，滿足自身的高鉀營養需求［44］。以上結果表明鉀離子轉運蛋白HAK在促進植物鉀營養吸收過程中發揮著重要的作用。

3.2 影響植株生長發育

鉀不僅是植物生長所必需的元素，也是一種重要的細胞溶質，鉀的缺失會限制植物細胞擴張，HAK轉運蛋白通過吸收鉀影響植物的生長發育。利用田間試驗發現，OsHAK5超表達水稻與野生型相比株高降低，分蘗增加，該基因敲除后植株株高同樣降低，但其分蘗數與野生型相比減少，結實率也大幅下降［45］。水稻OsHAK16敲除后影響了植株的生長，與野生型相比植株根莖干重降低［26］。OsHAK1被敲除后植株蔗糖運輸途徑受損，根系生長較弱，發育遲緩，花粉活力、生育率與穗肥力均下降，敲除該基因后水稻根部與莖部生長受阻，種子發芽率及谷物產量均小于野生型［13，41］。這些結果表明在影響水稻的生長發育方面HAK鉀轉運蛋白發揮著重要作用。通過光學顯微鏡觀察，顯示含有CN-HAK1的煙草葉片厚度明顯比僅含CN和野生型的更厚（CN為TMV的一種抗性基因），這表明由HAK1引起的鉀營養吸收改善了植物的生理狀態并影響植物組織的形態［46］。研究發現，在低鉀環境下，AtHAK5突變植株根長與野生型相比明顯縮短［47］。過表達AtHAK5植株在低鉀培養基中生長時，其根毛長度和密度均比野生型增加，這表明AtHAK5可使擬南芥面對低鉀脅迫時作出適應性形態改變，促進根毛伸長［48］。在擬南芥AtHAK5突變植株中過表達SiHAK1，發現在低鉀條件下SiHAK1彌補了AtHAK5突變后植物的生長缺陷，其植株鮮重，根長度均比AtHAK5突變體顯著增加，說明SiHAK1也參與了低鉀環境下植物的形態學調整［42］。OsHAK21在擬南芥中的表達同樣完全恢復了AtHAK5突變體的低K+敏感表型［28］。因此，HAK家族在鉀介導的植物生長發育中發揮著重要的作用。

3.3 增強植物抗旱能力

干旱是常見的非生物脅迫，嚴重限制了作物的產量［49］。植物面對干旱脅迫的一種方式是通過積累K+等溶質改善細胞滲透勢來減少水分流失，提高耐旱性。研究表明，水稻敲除OsHAK1后對干旱脅迫的耐受性較低，在營養和生殖階段均表現為生長發育不良，而OsHAK1過表達幼苗與野生型相比對干旱脅迫表現出更好的耐受性，且比野生型多出35%的糧食產量［50］。過表達NtHAK1可提高煙草對干旱脅迫的耐受性［51］。干旱脅迫下影響桑樹MaHAK5的表達水平［41］。由此表明，植物利用HAK轉運蛋白增強自身的鉀積累，降低細胞滲透勢，增強抗旱能力。其次HAK家族可通過降低活性氧（Reactive oxygen species，ROS）積累量來維持植物體內的水分平衡。干旱脅迫下，植物會積累活性氧，通過有氧代謝產生有害物質，破壞DNA、蛋白質和碳水化合物，引起細胞死亡［52］。與野生型相比，OsHAK1過表達植株具有較低的脂質過氧化水平、較高的抗氧化酶活性（POX、CAT）和較高的脯氨酸積累，說明OsHAK1通過減少ROS的積累來維持植物細胞穩態［50］。以上研究結果表明，高親和鉀轉運蛋白HAK在降低細胞滲透勢、減少ROS積累及增強植物抗旱能力等方面發揮著重要的作用。

3.4 增強植物耐鹽性

高鹽環境利用膜通透性改變、代謝紊亂、有毒物質積累等途徑造成植物生長發育及形態的改變，植物維持胞內K+/Na+穩態對提高耐鹽性，保證自身生長發育等方面發揮著重要的作用［53-54］。鹽脅迫環境下，水稻根莖部位OsHAK16表達水平顯著上升，該基因的表達增加了植株鉀含量但沒增加鈉積累，OsHAK16顯著改善了高鹽敏感型酵母突變體的生長，提高植株耐鹽性［26］。鹽脅迫誘導了水稻根中OsHAK21的表達，OsHAK21突變體中凈Na+吸收率明顯提高，而凈K+吸收率被顯著抑制，OsHAK21的破壞擾亂了植株K+/ Na+穩態，導致鹽超敏反應［28］。OsHAK21、OsHAK27能 在342 mmol/L NaCl的酵母環境下進行生長，具有明顯的Na+抗性［25］。水稻OsHAK1具有鹽敏感性，高鹽環境下能促進植物吸收鉀，增強對鹽的耐受性［13］。OsHAK5是一種對鈉不敏感的鉀轉運蛋白，通過增加K+吸收、阻止Na+流入來維持細胞穩態，過表達OsHAK5增加了水稻幼苗K+/Na+比值和對鹽脅迫的耐受性，敲除OsHAK5后則導致幼苗對鹽脅迫敏感［9，55］。以上結論證明HAK鉀轉運家族在增強水稻耐鹽性方面發揮著重要作用。

擬南芥中AtHAK5進行F130S點突變后增加了植物的鉀吸收，提高了其在酵母中的抗鹽能力，同時AtHAK1，AtHAK6，AtHAK2也 參 與 調 控 了 擬南芥的耐鹽渠道［56-57］。獐茅原產于沿海地帶，其AlHAK轉運蛋白具有使植物在高鹽環境下保持較高K+/Na+比的能力［37］。星星草（Puccinellia tenuiflora）是一種優良的鹽生草，耐鹽性強，其PtHAK5鉀轉運蛋白在維持植株K+/ Na+比值，增強耐鹽性方面發揮重要作用［58］。鹽脅迫條件下，蘆葦植物中PhaHAK1、PhaHAK2介導的K+持續吸收和保持植株高K+/Na+比是導致蘆葦具有高度耐鹽性的原因之一［17，38］。高鹽環境下超表達外源基因AlHAK1可維持棉花（Gossypiumspp.）中較高的K+/Na+比，提高了轉基因棉花的抗鹽能力［59］。海草CnHAK1在高鹽環境維持植物K+/Na+穩態中發揮著重要的作用，在海水中K+濃度為11 mmol/L 時進行鉀的低親和轉運［39］。煙草NrHAK1插入酵母細胞后能使其在鹽脅迫環境下進行生長［40］。面對鹽脅迫時OsHAK5提高了煙草BY2細胞的耐鹽性，促進其生長［55］。大麥HvHAKI可使K+攝取缺陷型酵母進行高親和力K+攝取，并介導其進行低親和力Na+攝取［21］。在酵母實驗中谷子SiHAK1表現出高度的Na+不敏感性，甚至能在750 mmol/L的Na+環境中進行生長，且比HvHAK1更能忍受高鹽環境［42］。研究表明，辣椒CaHAK1在鹽脅迫下也促進植物K+吸收，具有明顯耐鹽性［31］。以上結果表明，高親和鉀離子轉運蛋白HAK參與了植物對鹽分脅迫的反應，在維持植株K+/Na+穩態中起著至關重要的作用。

3.5 增強植物抗病性

鉀營養充足有利于維持植株良好的生理狀態，減輕真菌、細菌及病毒對作物造成的危害，增強植物抗病性［60-62］。研究表明，接種煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）的CN-HAK1共 表 達煙草相比CN轉基因煙草和野生型部分抑制了植株HR反應，與野生型相比也沒有出現明顯的植株矮化，葉片畸形等癥狀，這表明煙草通過HAK1改善了植物細胞的營養狀況，增強了植株對TMV的抵抗力。通過對抗氧化酶（AOEs）SOD、CAT、POD活性、水楊酸（SA）含量及相關抗性基因表達量的檢測，證明CN與HAK1在轉基因煙草中協同增強了對TMV的抗性，這些結論證明HAK1可能通過參與SA防御途徑增強了煙草的TMV抗性，將病毒限制在比較小的壞死斑點中［46］。鉀營養充足有助于植物胞內信號傳導和免疫，相反鉀營養的流失可能觸發病原相關分子模式（PAMP）［63-64］。ILK1是一種改變植物生長發育，增強植株對flg22的反應和對高鹽高鉀的耐受性、提高對細菌病原體抵抗力的體外活性激酶［65-67］。HAK5可與ILK1激酶相互作用，其既可以促使植物在低鉀的環境中生長，又能夠促進對flg22誘導的響應。植物響應flg22誘導后根系生長受抑制，而HAK5突變體則破壞了這種抑制，HAK5突變細胞和用TEA（K+通道阻止程序）處理后的葉盤均表現出去極化速度顯著降低的現象，說明K+轉運是flg22誘導的植物生長抑制和PM去極化所必需的。這些證據表明，由HAK5和ILK1介導的鉀轉運影響了植物的免疫和應激反應，參與植物抗病性［68］。以上研究表明，HAK轉運蛋白不僅增強植物鉀營養積累，影響植物生長發育，提高抗旱耐鹽能力，在植物抗病方面也發揮著十分重要的作用。

4 結論與展望

高親和K+轉運蛋白HAK通過提高植物鉀離子的吸收，從而在增強植物對于病蟲害及高鹽干旱等脅迫的耐受性等方面發揮著重要作用。目前關于高親和K+轉運蛋白HAK作用機理的研究雖取得了一定進展，但是仍處于初步階段。首先該蛋白的許多功能還尚待發掘，目前HAK轉運蛋白只解析了當植物面對高鹽和干旱兩種非生物脅迫的響應過程，對HAK蛋白如何提高植物的抗病性也只停留在初步階段，當面對病蟲害時HAK如何調控植物增強耐受性的作用機理還需要進一步解析。其次HAK如何協作相關基因發揮功能的機理也尚未解析。最后應考慮如何將HAK鉀轉運蛋白的功能應用到生產實際中，如何應用分子育種和基因工程技術，將能介導植物鉀營養吸收，改善植物的生長發育，提高植物的耐鹽抗旱及抗病性的HAK基因轉入農作物，提高農作物的鉀營養吸收能力及對生物和非生物脅迫的耐受性，增加作物產量。