首次實現對線粒體DNA的基因編輯

來自細菌體的毒素是這套編輯體系的王牌。

CRISPR-Cas9基因編輯對生命科學領域的貢獻有目共睹，不過還在蓬勃發展中的它依然有不少難點尚未攻克，“線粒體DNA（mtDNA）編輯”就是其中一個重大難點。

很多科研人員試圖打破此局面。最近有捷報傳來：有人跳出了CRISPR-Cas9的傳統框架，借助一種獨特的細菌酶實現線粒體中DNA的編輯，2020年7月8日研究成果刊載在《自然》（Nature）雜志上。

當然，很多人會有兩個疑問：其一，我們為什么非要去編輯線粒體里那些少得可憐的DNA？其二，為什么線粒體基因要比細胞核里的基因難編輯得多？

何為堿基編輯

針對第一個問題，需要指出，mtDNA量雖少，但突變起來仍極具殺傷力。mtDNA在發生突變后，很可能引發某些母系遺傳的特定疾病，往往會對神經系統和肌肉造成損傷（線粒體也容易因此喪失制造ATP的能力）。

第二個問題里的難點在于線粒體的保護屏障。目前人類可以借助CRISPR-Cas9對幾乎每一個實驗生物體的基因組進行調整——但這類操作要成功，有個重要環節不能少：研究者需要用一串特定的RNA鏈將Cas9酶引導至他們希望編輯的那個DNA區域。

Cas9酶很重要，負責目標區域的DNA雙鏈解旋，令其成為可編輯的兩條單鏈（局部而非整體解旋）。在操作細胞核DNA時，這一切都沒問題；但當面對線粒體時，包覆在外的雙層膜會把Cas9酶擋在外面。所以問題的核心就是重要人員進不去線粒體。

目前有一些科學家希望基于一種超高精準度的基因編輯系統——人稱堿基編輯，解決線粒體基因編輯難題。

在詳述如何讓編輯工具進入線粒體內部之前，我們先介紹一下這個堿基編輯技術。顧名思義，操作者要對基因組里的單個堿基進行更改，如把胞嘧啶變成胸腺嘧啶。相比于一段一段地更改基因序列的常規基因編輯，精準操控每一個堿基的堿基編輯看起來已經把CRISPR的概念推到了極致。

2018年底，哈佛大學華裔科學家劉如謙收到一封電子郵件。信中來自華盛頓大學的微生物學家約瑟夫·穆格（Joseph Mougous）和同事在西雅圖做實驗時，發現一種由洋蔥伯克氏菌（Burkholderia cenocepacia）產生的毒素具有催化作用，可以將胞嘧啶（簡稱C）轉化為尿嘧啶（簡稱U）。

在DNA中不常見的U有著與胸腺嘧啶（簡稱T）相似的行為，所以如果轉化得到了U，在某種程度上就可以當作是得到了T。簡單一句話：來自洋蔥伯克氏菌的毒素可以有效地將基因組序列中的C轉化為T。

順著與穆格差不多的思路，劉如謙等人借助類似的酶實現了堿基編輯。該酶是胞苷脫氨酶的一種，而胞苷脫氨酶也是一種細菌毒素。

棄Cas9，用DddA

以上這些都只是在理論上建構出了堿基編輯的體系，但要在現實中完成線粒體內的堿基編輯就很難了。穆格和劉如謙的酶都存在缺陷：通常只能對解開了螺旋的DNA單鏈進行堿基更改。這自然引出了前文提到的Cas9酶難題：要想解旋DNA，就得帶上Cas9酶；可帶上了Cas9酶，就進不去線粒體。所以他們需要另覓他法。

不久后，穆格這邊有了好消息。他們發現了一種名為DddA的酶（胞苷脫氨酶的一種，雙鏈結構）可以直接作用于雙鏈DNA，無須依靠Cas9酶解旋。DddA開展工作時，能讓雙鏈DNA始終完好如初，潤物細無聲地完成“篡改”。

劉如謙和穆格一致認為，舍去Cas9酶，讓DddA單槍匹馬地殺向線粒體，就可以避開其外部膜的阻擋直搗基因組。最后的結果也確實如他們所愿。

不過在實際調用DddA的過程中，也存在不少難點。其中最主要的問題在于胞苷脫氨酶的本質是毒素，對哺乳動物的細胞有毒：DddA會把目力所及的全部胞嘧啶（C）都變成胸腺嘧啶（T），脆弱的生命體經不起這么狂躁的大換血。

要讓DddA為基因編輯所用，就要先“馴服”它。研究團隊將它分解成了兩部分（名為split-DddAtox）：彼此分離時，則均處于無活性狀態，對堿基不構成威脅；合體后，DddA就可以大展拳腳。另外，他們給兩個split-DddAtox都連上了TALE蛋白，進而成為TALE-split-DddAtox。

在一起進入線粒體之后，TALE蛋白會連接上目標DNA片段，接著兩個split-DddAtox也可以順勢合體，然后把C們轉化成T們。

另一個關鍵環節是帶路的向導。TALE-split-DddAtox需要有人領著它穿過內外兩層的線粒體膜，然后找到mtDNA。劉如謙等人給TALE-split-DddAtox標記了一段氨基酸序列，作為線粒體靶向信號，幫助前者順利抵達最終目的地。

換言之，他們用氨基酸序列代替以往的RNA，充當向導一角。實際上，有研究者認為，常規的CRISPR-Cas9 之所以沒法搞定線粒體的DNA，除了Cas9會被擋在外面，RNA向導不受線粒體歡迎可能也是原因之一。

還有一個問題來自于這個假T堿基。前面我們說過，酶實際上是把C變成了U；又因為U具有與T相同的堿基配對特性，所以我們才把它當成T來看待。本質屬于RNA的U在成為DNA鏈的一分子之后，會遭遇麻煩：尿嘧啶DNA糖苷酶（uracil-DNA glycosylase）總想把U干掉，再換上C。

鑒于此，研究團隊給TALE-split-DddAtox又加了一層保險：尿嘧啶糖基化酶抑制劑（UGI）。不僅保護U免受干擾，還將胞嘧啶的堿基編輯效率提高了8倍。

有望矯正49%的有害mtDNA突變

綜上，我們得到了一套超凡的線粒體基因編輯裝備，研究團隊稱其為DdCBE。它是這樣工作的：TALE-split-DddAtox跟著一段氨基酸序列，通過線粒體的雙層膜，抵達mtDNA處。接著，TALE蛋白鎖定并連接mtDNA上的目標區段。與此同時，兩個split-DddAtox合二為一成為DddA，開始啟動更改堿基的程序。

DdCBE及其正要進入的線粒體區域的示意圖

脫靶效應，即非預期位點的DNA修飾，是CRISPRCas9基因編輯的一個常見問題。在分析比對了編輯后的細胞與對照組細胞后，他們發現前者的細胞核中并未出現預期以外的DNA修飾。

研究團隊在論文里報告指出，這一套編輯體系有望矯正49%的已知有害mtDNA突變。

當然，劉如謙認為這項工作距離臨床應用還差很遠。盡管他們現階段的脫靶情況不明顯，但更多針對不同細胞類型的嘗試必不可少。

資料來源 Nature