CLCN2基因突變者尿液來源誘導多能干細胞的構建及定向分化神經細胞

陳灼林?劉佳?謝冰冰?甘周慶?鐘秀風?彭福華

【摘要】目的 建立和鑒定CLCN2基因突變患者尿液來源特異誘導多能干細胞（iPSC），并初步探討其神經分化能力。方法 收集臨床上1例CLCN2基因突變患者尿液細胞，將表達重編程因子OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT的附加型載體通過電轉染導入尿液細胞，使其重編程為iPSC，并繼續誘導其神經分化。通過Sanger測序、核型鑒定、免疫熒光、逆轉錄PCR、畸胎瘤實驗及定向分化等評價干細胞和神經細胞特性。結果 電轉后部分尿液細胞發生形態改變，形成邊界清楚的致密細胞克隆團;這些克隆狀生長的細胞可以連續傳代，具有正常核型，含有CLCN2基因無義突變，表達多能干性標記且無外源基因;裸鼠體內形成三胚層畸胎瘤;體外可定向誘導分化為神經干細胞和星形膠質細胞。結論 CLCN2基因突變患者尿液細胞可重編程為iPSC，并可體外分化為神經細胞，可為CLCN2基因突變相關疾病的研究提供重要材料。

【關鍵詞】誘導多能干細胞;CLCN2;白質腦病;神經分化

Establishment of urine-derived induced pluripotent stem cell line from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene and differentiation into neural cells Chen Zhuolin， Liu Jia， Xie Bingbing， Gan Zhouqing， Zhong Xiufeng， Peng Fuhua. Department of Neurology， the Third Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510630， China

Corresponding authors， Peng Fuhua， E-mail： pengfh@ mail. sysu. edu. cn; Zhong Xiufeng， E-mail： zhongxf7@ mail. sysu. edu. cn

【Abstract】Objective To construct and identify the urine-derived induced pluripotent stem cells （iPSC） from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene， and to initially explore their ability of neural differentiation. Methods Urine cells from one patient with CLCN2 gene mutation were collected and transfected with episomal plasmids carrying the OCT4， SOX2， KLF4 and SV40LT to be reprogrammed into iPSC， and then be differentiated into neural cells. The characteristic of the iPSC and the neural cells were verified by Sanger sequencing， karyotyping analysis， immunocytochemistry， RT-PCR， teratoma test， directed differentiation and so on. Results The transfected urine cells gradually appeared some clonal cell clusters with clear boundary， which could be continuously passaged， showed normal karyotype， contained homozygous CLCN2 mutation and expressed pluripotent markers without integration of exogenous genes. Three germ-layer teratomas were identified in the nude mice. These iPSC could be induced to differentiate into neural stem cells and astrocytes.? Conclusion Urine cells from one patient carrying homozygous mutations in CLCN2 gene can be reprogrammed into iPSC and neural cells， which can provide vital evidence for investigating CLCN2 gene mutation-associated diseases.

【Key words】Induced pluripotent stem cell;CLCN2;Leukoencephalopathy;Neural differentiation

CLCN2基因是編碼氯離子通道2（ClC-2）蛋白的基因。ClC-2在人體中分布廣泛，尤其在大腦中表達較高，其在調節水電解質平衡中發揮重要作用。CLCN2相關白質腦病（CC2L）是由CLCN2基因突變進而導致ClC-2功能障礙而引起的常染色體隱性遺傳病。CC2L患者常表現為視網膜脈絡膜病變或視神經萎縮、男性不育、小腦性共濟失調、認知障礙、學習障礙等，顱腦MRI常提示髓鞘空泡變性[1]。關于CC2L，僅有少量的病例報道，且由于尚無合適的疾病模型，其致病機制尚不明確，目前也無有效的治療手段。因此，創建用于研究CLCN2基因相關疾病的體外細胞模型很有必要。

隨著體細胞重編程技術的發展，獲取患者特異的誘導多能干細胞（iPSC）成為現實[2]。研究表明，iPSC具有向機體幾乎所有細胞分化的能力，不僅可構建多種體外細胞模型進行疾病機制的研究以及藥物篩查，還可用于替代移植治療[3-4]。本課題組旨在建立CLCN2突變患者特異iPSC系（CC2L-iPSC），為CLCN2突變相關疾病的發病機制及治療提供研究基礎。

材料與方法

一、標本來源

采集1例就診于中山大學附屬第三醫院神經內科的38歲女性患者的尿液。該例患者表現為雙手的意向性震顫、記憶減退、耳鳴及視力減退;體格檢查提示小腦性共濟失調;大腦MRI提示內囊、大腦腳和小腦中腳的白質出現異常的T1加權像低信號、T2加權像高信號，隨后的Sanger測序證實其CLCN2基因有1個純合致病突變（Exon20： c.2257C>T; p.Arg753Ter），其符合CC2L的診斷標準[5]。本實驗征得患者同意并簽署知情同意書，而且經中山大學附屬第三醫院倫理委員會批準。

二、細胞、質粒和主要試劑

1. 細胞和質粒

正常人IPSC系UE017及質粒pCEP4-miR-302- 367 cluster均由中國科學院廣州生物醫藥與健康研究院潘光錦研究組饋贈;pEP4-EO2S-ET2K 購自美國Addgene。

2. 主要培養基配方

尿液細胞培養液——由DMEM/Hams：F12 1：

1（Life Technologies）、10%胎牛血清（Gibco）、0.1

mmol/L非必需氨基酸（Gibco）、1 mmol/L Gluta MaxTM-1（Gibco）、0.1 mmol/L β-Mercaptoethanol （Gibco）和0.1 mmol/L Renal Cell Growth Medium（Lonza）、0.1 mmol/L Single Quotkit supplements（Lonza）、0.1 mmol/L penicillin/streptomycin（Gibco）配成;神經誘導培養基（Gibco）;增殖培養基——由Neurobasal Medium（Gibco）、Advanced DMEM/F-12（Gibco）和Neural Induction Supplement（Gibco）按49∶49∶2配成;星形膠質細胞分化培養基——由DMEM（Gibco）、1x N2和1%胎牛血清（Natocor）配成。

3. 其它主要試劑

L-gelatin基質膠（Millipore）;EDTA-胰蛋白酶（trypsin-EDTA，Gibco）;NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell試劑盒（Lonza）;Matrigel胚胎干細胞基質膠（Cornning）;mTeSR1TM培養液（Stem Cell Technologies）;EDTA （Invitrogen）;Accutase （Invitrogen）;Prime ScriptTM RT Master Mix試劑盒（Takara）;SYBR Premix EX Taq 試劑盒（Takara）;瑞氏-姬姆薩染色液（貝索生物）; BCIP /NBT、堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（碧云天生物）。引物均由英濰捷基（上海）公司合成，具體序列見表1。免疫熒光所用抗體信息見表2。

三、方 法

1. 尿液細胞的收集、擴增培養

采集CLCN2突變患者清潔中段尿500 ml，室溫下×400 g離心10 min后棄掉上清液。離心后的尿液細胞用磷酸鹽緩沖液（PBS）洗滌后加入2 ml尿液細胞培養液重懸。重懸后的細胞轉移至L-gelatin包被并加有每孔2 ml尿液細胞培養液的六孔板中，置于恒溫箱中培養。5 d后，當細胞群融合時，用0.25% trypsin-EDTA消化，并按1∶3傳代。

2. 尿液細胞的重編程

根據文獻[6]的方法進行操作，尿液細胞擴增至約1.5×106個/孔后，按NucleofectorTM Kit for primary mammalian epithelial cell 試劑盒的說明往尿液細胞中加入電轉緩沖液，并加入6 μg pEP4-EO2S-ET2K質粒以及4 μg pCEP4-miR-302-367 cluster質粒，通過Amaxa電轉儀進行電轉染（程序： T-020，Lonza）。轉染后的細胞按2×105個/孔接種于

Matrigel包被的六孔板中，加入尿液細胞培養液培養2 d后，換mTeSR1TM培養液于恒溫箱中（37℃，5%CO2）繼續培養，隔日換液。電轉染18 d后，挑取生長狀況良好且具有清晰邊界的克隆，轉移至新的Matrigel包被的六孔板中，加入mTeSR1TM培養液繼續培養。當細胞融合度達到80%時，用0.5 mmol/L EDTA消化，并按1∶3 ～ 1∶6進行傳代。

3. iPSC向星形膠質細胞定向分化能力鑒定

采用文獻[7]的誘導方案，iPSC傳代后第2日，換神經誘導培養基，每日換液，7 d得到原始神經干細胞（NSC）。加入Accutase細胞消化液把原始NSC消化為單細胞，按5×105個/孔接種于Matrigel包被的六孔板中，加入神經增殖培養基擴增培養，隔日換液，培養5 ～ 7 d后得到成熟NSC，此時可傳代或進行后續分化操作。進行星形膠質細胞分化時，把Accutase消化后的NSC按5×105個/孔接種于Matrigel包被的六孔板中，加入星形膠質細胞分化培養基，隔日換液，當細胞融合度達到80%時（5 ～ 7 d）用Accutase消化并按1∶4進行傳代，培養約25 d。

4. 核型鑒定

iPSC傳代6次后，融合度達到80%時，用0.2 μg/ml秋水仙堿在室溫中處理細胞2 h，然后加入0.5 mmol/L EDTA消化并收集細胞，加入0.075 mol/L

KCl溶液于37℃中處理20 min，然后用卡諾氏固定液（乙酸∶乙醇為1∶3）1 ml，在37℃中固定40 min。200 r/min離心5 min，加入1 ml卡諾式固定液重懸，吸取懸液滴在一干凈的載玻片上，然后置于75℃烘箱中3 h。最后，滴加5%的Giemsa染液染色20 min，自然晾干后在Olympus顯微鏡下進行標準G帶核型分析。

5. 基因突變分析

收集2×106 iPSC送往廣州金域醫學公司進行Sanger測序，并根據檢測結果用Swiss模型預測iPSC的ClC-2蛋白的三級結構[11]。

6. 免疫熒光染色

當生長在爬片上的iPSC、NSC和星形膠質細胞融合度達60%時，進行免疫熒光染色，操作步驟如下，加入4%多聚甲醛固定15 min，用PBS清洗3遍，加入封閉破膜液（10%驢血清/0.25% Triton X-100溶液1∶9）后于室溫中靜置1 h。吸走封閉破膜液，加入一抗，在4℃中孵育過夜（> 22 h）。吸走一抗，用PBS清洗3遍，避光中加入相應的二抗，避光孵育1 h。吸走二抗，用PBS洗滌2遍后加入DAPI溶液，避光靜置15 min，用PBS洗滌3遍后滴加抗熒光淬滅劑，置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。

7. 逆轉錄PCT（RT-PCR）檢測iPSC多能干性的表達及重編程因子的清除

iPSC傳代9次后，使用Trizol提取總RNA，按照Prime ScriptTM RT Master Mix的說明逆轉錄cDNA，PCR循環參數為： 95℃預變性2 min;95℃，30 s，35個循環;60℃，30 s;72℃，30 s;72℃，8 min。PCR結束后，取10 μl擴增產物進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電泳時間30 min。

8. 實時熒光定量PCT（qRT-PCR）檢測NSC和星形膠質細胞各基因的表達

使用SYBR Premix EX Taq 試劑盒進行qRT-PCR，擴增神經干細胞相關基因PAX6、Nestin、SOX2及星形膠質細胞相關基因S100β、GFAP。GAPDH 作為內參照。引物序列見表1。

9. 體內畸胎瘤形成實驗

收集CC2L-iPSC，加入mTeSR1溶液制成細胞懸液，與等量50X Matrigel混合后，分別注射到9只6周齡免疫缺陷的NOD-SCID小鼠（購于中山大學中山眼科中心動物實驗中心）中，每只小鼠注射雙后肢及后背共3個位點，每個位點注射200 μl細胞懸液（含1.5×106 iPSC）。每3日觀察并記錄小鼠情況直至畸胎瘤形成。處死小鼠并切除畸胎瘤組織，把畸胎瘤用甲醛固定、石蠟包埋后切片，并用HE染色，最后在顯微鏡下觀察不同類型組織結構并拍照。

結果

一、CLCN2患者尿液細胞重編程為iPSC

收集CLCN2突變患者約500 ml清潔中段尿，離心后得到的尿液細胞經擴增后在光鏡下呈正常的細胞形態，主要有2種細胞類型，1型細胞較小，呈紡錘狀，大小基本一致，數量較多;2型細胞較大，呈均質圓形，數量較少且繁殖能力較低（圖1B-a、b）。

通過非整合重編程的方法（圖1A），把攜帶OCT4、SOX2、KLF4、SV40LT轉錄因子的ORIP/EBNA1附著體和miR-302-367 cluster經電轉染導入尿液細胞，9 d后，鏡下可見部分尿液細胞發生形態改變，呈不規則扁平狀聚集（圖1B-d）。18 d后得到高核質比、輪廓清晰、中心緊湊的iPSC克隆（圖1B-f）。把目標克隆挑取再培養15 d后可得到細胞形態均一、高核質比的iPSC克隆（圖1C），這些克隆可進行穩定傳代，核型鑒定結果正常（圖1D）。本研究最終共獲取5個iPSC克隆，并對其中3個克隆（C4、C12、C13）進行了充分的驗證。

二、CC2L-iPSC表達多能性標記，不含外源因子及整合基因，在體內可形成畸胎瘤

在至少傳代12次后，對CC2L-iPSC進行RT- PCR，結果表明所有外源重編程因子（OCT4、SOX2、KLF4、SVL40T和miR-302-367）和游離質粒DNA（ORIP和EBNA-1）均呈陰性（圖2A）。CC2L-iPSC克隆均表達包括OCT4、SOX2、NANOG、GDF3和DNMT3B在內的干細胞多能性基因（圖2B）。免疫熒光染色還證實，已建立的CC2L-iPSC表達典型的多能性蛋白標記物SSEA4、NANOG、OCT4和TRA-1-60（圖2C）。把CC2L-iPSC注射到小鼠體內8周后，可得到畸胎瘤，經HE染色可見三胚層結構，分別是包括內胚層的腸上皮、中胚層的軟骨、外胚層的神經組織（圖2D）。

三、 CC2L-iPSC包含純合的CLCN2突變

與NCBI基因數據庫中的CLCN2基因序列對比（圖3A），Sanger測序證實CC2L-iPSC包含純合突變c.2257C> T（p.Arg753Ter）（圖3B），與患者血液的Sanger測序結果一致。基于已確認的氯離子通道1（ClC-1）結構，本研究通過SWISS-MODEL對ClC-2蛋白的三級結構進行預測，預測模型表明ClC-2為同源二聚體，c.2257C > T突變導致蛋白C端截短（圖3C）。

四、CC2L-iPSC能夠向神經方向分化，形成星形膠質細胞

加入神經誘導培養基后，iPSC無需通過形成神經花環即可直接分化為NSC（圖4A）。在誘導分化過程中，細胞呈單層扁平狀集落樣增殖，且體積略變小，呈均一圓球狀，細胞透亮度增加（圖4B-a）。消化后重新接種的NSC呈鏈狀分布（圖4B-b），單個細胞呈扁平不規則多邊形，細胞體積增大（圖4B-c）。加入星形膠質細胞培養基后，單個細胞進一步呈不規則多角形，細胞體積進一步增大，胞質淡染（圖4B-d）;隨著傳代次數的增加，細胞胞質逐漸明顯、邊界逐漸銳利清晰（圖4B-e ～ f）我們以健康人尿源iPSC系UE017進行同樣誘導分化操作，把所得到的NSC和星形膠質細胞作為對照組，與CC2L-iPSC C4和C12 2個細胞系的分化所得細胞進行qRT-PCR，結果表明所得到的NSC（P2代）表達PAX6、SOX2和NESTIN神經干細胞相關基因;所得到的星形膠質細胞（25 d）表達GFAP和S100β，且它們的表達量均與健康對照組相近（圖4C）。對P2代NSC進行免疫熒光染色，可見Nestin和PAX6均呈陽性（圖4D）;25 d的星形膠質細胞免疫熒光結果顯示其表達膠質細胞特異性分子標志GFAP、S100β和VIMENTIN（圖4E）。

討論

ClC-2在人體中廣泛表達，研究表明CLCN2基因突變與生殖系統疾病、消化系統疾病、呼吸系統疾病以及神經系統疾病等均有關，但是，其具體機制尚不清楚[8-12]。由于iPSC能夠自我更新并分化為人體中絕大多數類型的細胞和組織，因此其已成為研究發育和疾病（尤其是遺傳性疾病）的重要材料。本課題組采用無創且非整合的方法首次成功構建CLCN2突變患者特異性iPSC，并對其進行充分的驗證，確認它們來源于CLCN2突變患者尿液細胞，具有正常的核型，并證實其具有典型的iPSC特征，包括表達多能性基因和多潛能分化能力等。這些包含CLCN2遺傳背景的iPSC可以作為體外細胞模型用于進一步的研究，以揭示ClC-2功能障礙對各個器官、系統的影響。

CC2L是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，是由于CLCN2基因突變致ClC-2氯化物通道蛋白功能異常引起的，其與大腦中水電解質平衡有關。在中樞神經系統中，ClC-2主要分布在少突膠質細胞周圍的縫隙連接處以及血管周圍基底的星形膠質細胞末端。有學者認為，ClC-2在神經活動后會通過星形膠質細胞合胞體重吸收Cl-以維持神經元的興奮性[13]。CLCN2的突變可能影響ClC-2通道對Cl-的通透性而導致其重吸收功能障礙，這可能解釋了CC2L的發病機制[11]。另一項基于果蠅的研究表明，ClC-2通道在神經系統發育中起著重要作用，因為它們參與控制神經膠質和神經元的發育形成以及兩者的連接，這也可能與CC2L有關[14]。然而，CLCN2基因突變疾病的確切分子機制仍然有待進一步闡明。雖然CLCN2基因敲除（K/O）小鼠模型已被成功構建，但這些小鼠并不能真實反映CC2L的遺傳背景。本研究預測突變后的ClC-2的三級結構僅顯示其C端截短了，表明它可能保留部分功能，正如一些研究者指出，在CC2L患者中ClC-2的功能并不完全丟失，相反，K/O小鼠中的ClC-2功能明顯受損。因此，構建一個能更真實反映CC2L的疾病模型非常必要。本課題組和其他研究者的研究表明，人類iPSC可以成功地分化為神經細胞和組織，包括大腦和3D視網膜等，這些研究可為建立合適的CC2L疾病特異性細胞模型提供基礎，以進一步探究其發病機制及進行藥物篩查。此外，這些患者的iPSC還可在通過基因編輯技術進行突變校正后為細胞治療提供細胞來源。

皮膚成纖維細胞和血液細胞、肝細胞、羊水細胞等已被廣泛用作構建iPSC的親代細胞，但它們是通過侵襲性方式采集獲得的[2]。相比之下，本研究通過無創尿液收集的方式獲得的細胞來源，取材方便，更易被患者接受。同時，有研究表明尿路上皮細胞較皮膚成纖維上皮更具有上皮的特性，其重編程效率比血液細胞和皮膚成纖維細胞更為高效[6]。此外，整合基因組的病毒感染方法會使外源基因隨機但永久地整合到宿主基因組中而帶來潛在的風險，如產生插入突變、影響分化潛能導致腫瘤發生等。相比之下，本研究采用非整合方法，pEP4-E02S-ET2K質粒含有的ORIP/EBNA1元件可以使其攜帶的OCT4、SOX2、KLF4和SV40LT以游離體的形式穩定存在，并有利于游離基因組的核轉移。pEP4-E02S-ET2K質粒的復制周期與供體細胞基本相同，因此在重編程過程中，隨著細胞的增殖，其能不斷表達轉錄因子。當iPSC形成后，因為iPSC的增殖速度較供體細胞和質粒更快，質粒因復制不同步便會隨著iPSC的增殖而逐漸丟失，得到的iPSC細胞一般在經過5 ～ 10代的培養后就沒有附加載體質粒的存在了，此方法較之傳統的整合方法更為安全且更適用于臨床。

為了驗證此白質腦病患者來源的iPSC能否進行神經分化，我們采用成熟的單層貼壁神經定向誘導分化方案，把其向神經方向定向誘導分化。結果表明本研究所構建的CC2L-iPSC可以正常分化為神經干細胞和星形膠質細胞，初步的分化結果顯示其各項細胞相關基因的表達與正常細胞大體相當，這表明CC2L-iPSC可被用于構建白質腦病的體外細胞模型。綜上所述，本課題組建立了一個將尿液細胞通過非整合的方法誘導為iPSC的方案，有望被用于CLCN2基因突變的致病機制和治療等研究。然而，在目前已報道的CC2L病例中，存在不同的CLCN2基因突變類型，本課題組僅構建了攜帶其中一種突變類型的iPSC細胞系，也只是初步鑒定了所獲得的CC2L患者來源細胞的iPSC重編程及星形膠質細胞分化能力，沒有對重編程效率以及CC2L發病機制進行探討。接下來我們希望能發掘更多CC2L病例，或通過基因編輯技術等構建不同突變類型的iPSC，擴大樣本量，建立CC2L患者特異性的iPSC細胞庫，為今后深入研究CC2L發病機制及治療方法提供便利。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2020-02-16）

（本文編輯：洪悅民）