玳玳果黃酮提取物效應組分新橙皮苷及柚皮苷敲出分離制備

熊朝棟，陳 丹，洪麗婷，劉秀棉，余文靜，黃曉靖

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

玳玳又稱代代（Citrus AurantiμmL. var daidai Tanaka），是蕓香科柑桔亞屬植物，為酸橙的變種，藥食同源，在福建閩北地區建有基地大量栽培，四川、浙江等地也有栽培。 玳玳果含有豐富的黃酮類成分，臨床多用于胸腹滿悶脹痛、食積不化、痰飲等病癥的治療［1-2］。 由玳玳果提取的有效部位玳玳果黃酮提取物［3-5］，具有良好的降血脂及抗氧化活性［6-8］，以及有多組分和多靶點作用的特點，其中主要特征效應組分為新橙皮苷、柚皮苷等［9-13］。制備薄層色譜法（PTLC）是由普通薄層色譜［15-16］衍化而來的一種高提取率、無殘留的組分快速分離技術，簡便快捷，可在適宜的展開體系中實現多個目標成分的快速分離［14-15］。 高壓制備液相色譜（PHPLC）也是一種常見的分離目標化合物的技術手段， 可從天然產物中分離制備化合物，得到高純度的化合物單體，既可以制備對照品，又是中藥活性成分分離和臨床研究的理想方法。 本實驗采用制備薄層色譜結合高壓制備液相色譜，敲出分離玳玳果黃酮提取物中的主要效應組分，并通過高效液相色譜法檢測分離的效應組分純度，從而建立能快速、高效地從玳玳果黃酮提取物敲出制備純度大于98%新橙皮苷及柚皮苷的方法，為進一步研究評價玳玳果黃酮提取物中調控脂質代謝關鍵效應組分奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters 2695 高效液相色譜儀、Waters 2998 PDA 檢測器（美國 Waters 公司）；島津 LC-8A高壓制備液相、SPD-10A 紫外檢測器（日本島津公司）；XS 205 十萬分之一電子天平、AR 2140 萬分之一電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；DHG-9240 型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司）；DZF-6050 真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

1.2 試藥 玳玳果飲片由福建恒馨天然香料有限公司提供，經福建中醫藥大學中藥鑒定教研室范世明高級實驗師鑒定。 玳玳果黃酮降脂提取物（自制，總黃酮含量86.54%，批號：20190401）；柚皮苷對照品（南京廣潤生物制品有限公司，純度≥98%，批號：GR-133-140506）；新橙皮苷對照品（南京廣潤生物制品有限公司，純度≥98%，批號：GR-133-140403）；AB-8 樹脂（天津市光復精細化工研究所，批號：20190313）；硅膠G（國藥集團化學試劑有限公司，批號：0170206）；甲醇、乙腈為色譜純；水為超純水；無水乙醇、三氯甲烷、碘等其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 玳玳果黃酮提取物的制備 取玳玳果飲片粗粉，6 倍量 75%乙醇回流提取 3 次，每次 2 h，合并提取液。 回收乙醇至浸膏狀，于50 ℃下減壓干燥成粉，即得玳玳果黃酮粗提物。 使用AB-8 大孔吸附樹脂濕法裝柱；配制上樣濃度為6.0～8.0 g/L 粗提物溶液，調節 pH 值為 4～5，上樣流速為 2 BV/h，依次用 4 BV（柱體積）水洗脫，流速 2 BV/h；4 BV 30%乙醇洗脫，流速2 BV/h；4 BV 50%乙醇洗脫，流速 2 BV/h，收集濃度為50%乙醇溶液第 0.5～2.0 BV 洗脫液，回收溶劑，得浸膏；將浸膏置50 ℃下減壓干燥成粉，即得玳玳果黃酮提取物。

2.2 PTLC 法敲出分離新橙皮苷與柚皮苷

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取同一批次玳玳果黃酮提取物干燥粉末約30 mg，加入10 mL 甲醇，超聲5 min 使溶解，即得濃度為 3.0 mg/mL 的玳玳果黃酮提取物供試品溶液。

2.2.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取新橙皮苷、 柚皮苷對照品適量， 分別加甲醇制成濃度1.0 mg/mL 新橙皮苷對照品溶液、濃度 1.0 mg/mL 柚皮苷對照品溶液。

2.2.3 敲出分離新橙皮苷及柚皮苷 鋪制厚度約1 mm 的20 cm×20 cm 制備薄層板，供試品溶液條狀點樣，氯仿-甲醇-水（13∶6∶2）的下層溶液為展開劑，預飽和15～20 min，展開，取出板，揮干溶劑。碘蒸氣顯色，新橙皮苷及柚皮苷對照品示蹤。 實驗結果顯示：供試品色譜中，在與對照品色譜斑點相應的位置上，出現效應組分新橙皮苷和柚皮苷的棕黃色條帶。 分別刮取含效應組分新橙皮苷與柚皮苷的硅膠條帶，采用60%乙醇分別解吸附洗脫，收集洗脫劑，減壓干燥，即得新橙皮苷粉末、柚皮苷粉末。按公式計算：

PTLC 法得率 /%＝（MPHPLC產物/M玳玳果黃酮提取物）×100%

柚皮苷與新橙皮苷粉末得率分別為23.15%和26.77%。 制備薄層色譜結果見圖1。

圖1 玳玳果黃酮提取物制備薄層色譜分離結果圖

2.3 PHPLC 法分離純化新橙皮苷及柚皮苷

2.3.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取“2.2.3”項下制得柚皮苷及新橙皮苷粉末各適量，分別加入適量甲醇，超聲5 min 溶解樣品，制得濃度為3.0 mg/mL的供試品溶液。

2.3.2 色譜條件 色譜柱高壓制備柱Ultiamte XBC18（10 mm×250 mm，5 μm）；保護柱 XB-C18（5 μm）；流速3.0 mL/min；檢測波長284 nm；溫度為室溫；進樣量 100 μL。

2.3.3 新橙皮苷及柚皮苷的純化 實驗分別考察流動相的甲醇-0.5%甲酸水體積比為 1∶1、2∶3、11∶19時，提取物敲出的效應組分柚皮苷及新橙皮苷分離純化效果。實驗結果表明：當流動相的甲醇-0.5%甲酸水體積比為11∶19 時，新橙皮苷、柚皮苷與其他組分間的分離效果最佳，分離度＞1.5，故采用“2.3.2”項下色譜條件進一步分離純化PTLC 法分離的柚皮苷及新橙皮苷粉末。 分別收集含柚皮苷及新橙皮苷的流動相，減壓干燥，成粉，即得新橙皮苷與柚皮苷純品。 按公式計算：

PTLC 法結合 PHPLC 法得率 /%＝（MPHPLC 產物/M 玳玳果黃酮提取物）×100%

柚皮苷與新橙皮苷純品得率分別為21.73%和24.87%。 高壓制備液相色譜分離結果見圖2。

2.4 新橙皮苷與柚皮苷純品分析

2.4.1 供試品溶液的制備 分別精密稱取“2.2.3”項下和“2.3.3”項下所得敲出物（新橙皮苷與柚皮苷）各約 10 mg［16-17］，置 50 mL 量瓶，加甲醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取1.0 mL 于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得PTLC新橙皮苷供試品溶液、PTLC 柚皮苷供試品溶液，PHPLC新橙皮苷供試品溶液、PHPLC 柚皮苷供試品溶液。

2.4.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取柚皮苷、新橙皮苷對照品適量［17-18］，分別置于 50 mL 量瓶，加適量甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，分別精密量取柚皮苷對照品儲備液和新橙皮苷對照品儲備液各5.0 mL 至50 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得含柚皮苷濃度為0.011 84 mg/mL 及新橙皮苷濃度為0.013 50 mg/mL 的混合對照品溶液。

2.4.3 色譜條件 色譜柱250-4 lichrocart C18（250 mm×4 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.1%磷酸水溶液（22∶78）；流速 1.0 mL/min；檢測波長 284 nm；柱溫為 25 ℃；進樣量 20 μL。

2.4.4 標準曲線制備及線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液 1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL 分別置于10 mL 量瓶，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。 按“2.4.3”項下分析，記錄色譜圖。以峰面積為縱坐標，對照品溶液濃度為橫坐標，繪制標準曲線。 實驗結果表明：柚皮苷在 11.84～47.36 μg/mL 濃度范圍呈良好線性關系，回歸方程為Y1＝1.673×104X1－3.374×103，r＝0.999 8；新橙皮苷在 13.50～54.00 μg/mL 濃度范圍呈良好線性關系，回歸方程為Y2＝2.403×104X2－2.615×103，r＝0.999 9。

2.4.5 PTLC 結合PHPLC 敲出效應組分純化結果分析 分別取PTLC 新橙皮苷供試品溶液、PTLC 柚皮苷供試品溶液，以及PHPLC 新橙皮苷供試品溶液、PHPLC 柚皮苷供試品溶液，按“2.4.3”項下色譜條件，每個樣品進樣3 次，分析，計算平均純度。 實驗結果表明：PTLC 法敲出分離效應組分柚皮苷純度為69.24%，新橙皮苷單體純度為75.45%；結合PHPLC 法進一步純化效應組分后柚皮苷純度為98.81%，新橙皮苷純度為98.84%。 結果見表1，圖3。

表1 玳玳黃酮提取物效應組分分離純化測定結果%

圖3 效應組分純度測定結果高效液相色譜圖

3 討 論

PTLC 是在薄層分析色譜的基礎上，通過增加薄層的厚度，使其載樣量明顯高于分析型薄層，達到對多種化合物制備分離提純的目的。 常用的制備薄層色譜多為硅膠吸附色譜，其處理樣品量可達1～500 mg。 為了使分離產物不變性，實驗采用碘蒸氣對效應組分以對照品示蹤顯色。 由于碘蒸氣與效應組分柚皮苷與新橙皮苷結合方式為物理結合，該過程可逆，碘蒸氣與效應組分的結合物在常溫下放置時碘蒸氣自然揮發，使柚皮苷與新橙皮苷恢復原有狀態。

PHPLC 技術發展迅速，廣泛用于藥物及生物制品的純化，作為一種快速、高效的分離方法，具有良好的發展前景。 實驗在摸索高壓制備液相色譜分離樣品的條件時，將分析型色譜柱接入高壓制備液相色譜上，確定樣品在分析型色譜柱上的分離條件，再通過線性放大，獲得樣品在高壓制備液相色譜的初步分離條件，進一步篩選優化高壓制備液相色譜條件。

實驗中采用PTLC 對提取物的效應組分先進行敲出分離，效應組分含量可達70%以上，再結合PHPLC 對效應組分進一步分離純化，可使效應組分新橙皮苷、柚皮苷最終純度達98%以上，且最終柚皮苷得率為21.73%，新橙皮苷得率為24.87%。提示本實驗建立的PTLC 結合PHPLC 敲出分離玳玳果黃酮提取物效應組分方法可行，為后續課題組進一步深入研究提取物及效應組分調控脂質代謝機制研究奠定了物質基礎。