不同產地桔梗HPLC指紋圖譜及化學模式識別研究

張 遲，黃戎婕，曾金祥*，鐘國躍，韓風雨，于秀玲

1江西中醫藥大學中藥資源與民族藥研究中心，南昌 330004；2內蒙古天奇中蒙制藥股份有限公司，赤峰 024000

桔梗為重要的藥食兩用大宗藥材，來源于桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.) A.DC.的干燥根，臨床常用于咳嗽痰多、胸悶不暢、咽痛音啞、肺癰吐膿等[1]。該種分布廣泛，在南至我國的兩廣、西至川西，東至日本、朝鮮，北至西伯利亞地區均有分布。桔梗在我國東北、華東、華中、西南等地多有栽培，現藥材也主要來自于栽培生產，以內蒙古赤峰市的種植面積最大，常年種植面積約5～7萬畝，其產量約占全國總產量的50%～60%。既往研究表明，桔梗中含有皂苷、黃酮、酚酸類等多類成分，其中皂苷類成分系桔梗鎮咳祛痰的主要活性成分，目前已從桔梗中分離得到70余種皂苷類化合物[2-6]。

因此，基于桔梗主要皂苷類成分構建科學合理的桔梗藥材質量控制方法對于其臨床應用及新藥開發極為必要。既往研究多數側重桔梗化學成分的分離以及測定其中極少數幾個皂苷類成分[7-11]，部分研究或以配備蒸發光散射檢測器的高效液相色譜構建指紋圖譜[12-14]，但未見以高效液相色譜聯合紫外-可見光檢測器構建指紋圖譜并結合化學模式識別對桔梗質量控制和品質評價進行探討的報道。因此，本研究建立桔梗的HPLC指紋圖譜，并首次結合相似度評價、聚類分析、主成分分析以及正交偏最小二乘判別分析等多種模式識別方法對桔梗質量控制和品質評價進行探討。

1 儀器與材料

1.1 儀器

島津LC-20AD高效液相色譜儀，配備PDA紫外-可見光檢測器(日本島津公司)；KQ-5200DB型超聲清洗機(昆山市超聲波儀器公司)；CP-214電子天平(上海奧豪斯有限公司)；R-210旋轉蒸發儀(瑞士步琪公司)；DZKW-S-6型電熱恒溫不銹鋼水浴鍋(北京市永光明醫療儀器有限公司)；DHG-111型電熱恒溫鼓風干燥箱(上海三發科學儀器有限公司)。

1.2 試劑

甲醇、濃氨水、正丁醇(分析純，西隴化工股份有限公司)；乙腈(色譜純，美國TEDIA公司)；超純水(實驗室自制)；對照品桔梗皂苷D3(批號：P23N8F48914)、去芹糖桔梗皂苷D3(批號：P15N8F48398)、桔梗皂苷D2(批號：P15N8F48273)、桔梗皂苷D(批號：Z08J9L52294)購自于上海源葉生物科技有限公司；去芹糖桔梗皂苷D(批號：PRF8032746)購自于江西本草天工科技有限公司；以上對照品純度均≥98%；遠志皂苷D2、遠志皂苷D為實驗室自制，純度均≥95%。部分桔梗皂苷結構信息見表1和圖1。

表1 桔梗皂苷結構信息

圖1 母核類型Fig.1 Parent nucleus

1.3 藥材

桔梗藥材共15批，采集或收集于內蒙古、山東、河北、陜西、吉林、重慶、甘肅等7省市區(其中3批為野生樣品)，經江西中醫藥大學鐘國躍研究員鑒定為桔梗科植物桔梗Platycodongrandiflorum(Jacq.)A. DC.的干燥根。內蒙古赤峰產區樣品因氣候條件原因，藥材采挖后遵循產地初加工工藝，攤開任其自然晾干(耗時較長)；其它產地樣品通常在采挖后直接曬干。樣品信息見表2。

表2 桔梗樣品信息

2 方法和結果

2.1 色譜條件

YMC Hydrosphere C18分析色譜柱(250×4.6 mm，5 μm)，流動相為水(A)-乙腈(B)，梯度洗脫：0～40 min，15%～25% B；40～80 min，25%～30% B，流速0.8 mL/min，檢測波長210 nm，柱溫35 °C，進樣量10 μL。

2.2 溶液配制

2.2.1 供試品溶液制備

參照中國藥典方法[1]略微改動，取桔梗粉末(過二號篩)約2 g，精密稱定，精密加入50%甲醇50 mL，稱定重量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30分鐘，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續濾液25 mL，置水浴上蒸干，殘渣加水20 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用氨試液50 mL洗滌，棄去氨液，再用正丁醇飽和的水50 mL洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇使溶解，定容至5 mL。分析前過0.22 μm微孔濾膜，備用。

2.2.2 對照品溶液制備

精密稱定桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D3、去芹糖桔梗皂苷D、桔梗皂苷D2、桔梗皂苷D、遠志皂苷D2、遠志皂苷D對照品適量，加甲醇制成質量濃度分別為0.25、0.34、0.46、0.97、3.19、0.65、0.30 mg/mL的混合溶液，備用。

2.3 指紋圖譜方法學考察

2.3.1 精密度實驗

取S1樣品，按“2.2.1”項下處理供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件連續進樣6次，記錄色譜圖。以12號色譜峰為參照峰，計算色譜圖中各共有峰相對保留時間的RSD<0.13%，相對峰面積的RSD<1.61%。結果說明儀器精密度良好，符合指紋圖譜的要求。

2.3.2 穩定性試驗

取S1樣品，按“2.2.1”項下方法處理供試品溶液，以“2.1”項下色譜條件分別在 0、4、8、12、16、24、48 h進樣，記錄色譜圖。以12號色譜峰為參照峰，計算色譜圖中各共有峰相對保留時間的RSD<0.10%，相對峰面積的RSD<2.38%。結果表明供試品在48 h內穩定性良好。

2.3.3 重復性試驗

取S1樣品，按“2.2.1”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件分別進樣，記錄色譜圖。 以12號色譜峰為參照峰，計算色譜圖中各共有峰相對保留時間的RSD<0.87%，相對峰面積的RSD<2.73%。結果表明供試品制備方法重復性良好。

2.4 桔梗藥材HPLC指紋圖譜及技術參數

2.4.1 指紋圖譜的建立

取15批桔梗藥材，按“2.2.1”項下方法制備供試品，在“2.1”項下的色譜條件進行分析，記錄色譜圖，利用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012)”對不同產地15批次桔梗藥材的指紋圖譜進行數據分析，設置S1為參照圖譜，采用中位數法并進行自動匹配，生成15批桔梗藥材的HPLC指紋圖譜及共有模式對照圖譜(見圖2和圖3)。

圖2 15批桔梗藥材的HPLC指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprint of 15 batches of Platycodins Radix

圖3 桔梗藥材的共有模式對照圖譜Fig.3 Reference fingerprint of Platycodins Radix

2.4.2 特征峰的標定

根據保留時間標定特征指紋峰，對15批桔梗HPLC指紋圖譜測定結果進行比較分析，發現21個特征峰是15批桔梗共有的，因此確定這21個峰為特征指紋峰，共有峰的峰面積總和大于總峰面積的90%。通過對照品比對，確定14號峰為桔梗皂苷D3，16號峰為去芹糖桔梗皂苷D3，17號峰為去芹糖桔梗皂苷D，18號峰為桔梗皂苷D2，19號峰為桔梗皂苷D，20號峰為遠志皂苷D2，21號峰為遠志皂苷D。桔梗藥材樣品和混合對照品的HPLC圖譜見圖4。以峰面積較大、峰形較好且保留時間居中的12號峰作為參照峰，計算其他各共有峰和參照峰的峰面積比值即相對峰面積，結果見表3。

表3 15批桔梗指紋圖譜中共有特征峰的相對峰面積

表4 15批桔梗指紋圖譜相似度評價

續表4(Continued Tab.4)

2.4.3 相似度評價

將不同產地15批次桔梗藥材的指紋圖譜導入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(2012)”對相似度進行評價，結果見表4。15批桔梗與對照指紋圖譜相比較相似度都在0.9以上，介于0.927～0.991之間，表明各產地間的桔梗有較高的一致性。

2.5 聚類分析

采用SPSS 25 統計軟件對桔梗進行聚類分析，將15批桔梗的相對共有峰峰面積導入到SPSS 25 統計軟件，以組間連接法及皮爾遜相關性作為分類依據獲得分析結果(見圖5)。當分類距離為20時，15批桔梗分為兩類，S6、S13、S15三個野生樣品聚為一類，其余各地的栽培品種聚為一類，這提示野生生長的桔梗和人工種植的桔梗存在一定的差異。當分類距離為15時，15批桔梗樣品分為三類，即3個野生樣品為一類，S11和S12聚為一類，其余產地樣品聚為一類。

圖5 聚類分析結果Fig.5 Results of hierarchical cluster analysis

2.6 主成分分析

采用SPSS 25 統計軟件對桔梗進行主成分分析，將15批桔梗藥材共有峰峰面積經過SPSS標準化處理后，計算相關矩陣的特征值即方差貢獻率，結果見表5。以特征值大于1為提取標準，得到了4個主成分的累計方差貢獻率為90.275%，能夠較好的代表指紋圖譜中的大部分信息，矩陣結果見表6。由結果可知，第一主成分的信息主要來源于色譜峰4、6、9、13～21；第二主成分的信息主要來源于色譜峰3～8、11和12；第三主成分的信息主要來源于色譜峰1、2、10～12；第四主成分的信息主要來源于色譜峰7、10～12、14。利用SIMCA 14.1分析軟件繪制主成分分析得分圖，見圖6。15批桔梗被分為明顯的3類，S11和S12位于圖的上方分為一類；S6、S13和S15位于圖的右下方分為一類；其余樣本基本位于圖中央的位置分為一類，PCA結果與聚類分析基本一致，也進一步驗證了聚類分析的分類結果。

2.7 正交偏最小二乘判別分析

正交偏最小二乘判別分析法(orthogonal partial least squares discriminant analysis,OPLS-DA)是常用來處理分類和判別問題的一種有監督的判別分析法。采用SMICA 14.1對不同產地的15批桔梗藥材共有峰峰面積進行OPLS-DA分析，OPLS-DA擬合的模型R2X=0.811，R2Y=0.972，Q2=0.683，均大于0.5，表示擬合的模型穩定可靠，并具有較好的預測性，可以作為桔梗指紋圖譜的模式識別方法。15批桔梗的OPLS-DA得分圖見圖7。另外，以變量投影重要性(variable importance in projection,VIP)大于1篩選對分組結果產生較大影響的色譜峰，結果見圖8，它們從大到小分別是色譜峰6、5、13、9、8、3、12、18、7、15、20、11和4。

表5 特征值和方差貢獻率

表6 主成分初始因子載荷矩陣

圖6 主成分分析得分圖Fig.6 PCA score figure

圖7 OPLS-DA得分圖Fig.7 OPLS-DA score figure

圖8 OPLS-DA的VIP圖Fig.8 OPLS-DA VIP figure

3 討論

桔梗為藥食兩用大宗藥材，且主要藥效成分為桔梗皂苷，其品質評價與質量控制方法研究具有重要意義。本研究構建桔梗主要皂苷類成分HPLC指紋圖譜并鑒定了其中7個皂苷成分，結合相似度評價、聚類分析、主成分分析和正交偏最小二乘判別分析等多種化學模式識別方法，與已有僅以含量測定[7-11]或指紋圖譜[12-14]的品質評價與質量控制方法相比，不僅可有效評價桔梗藥材品質的一致性，同時還可闡明桔梗藥材品質差異形成的主要因素，因而為桔梗的品質評價與質量控制提供了更為豐富的信息。

化學模式識別的數據來源于指紋圖譜色譜峰面積，因此指紋圖譜的質量直接影響化學模式的分析結果。為構建良好的指紋圖譜，本研究對樣品的制備方法、檢測波長、流動相組成及柱溫均進行了考察優化。結果發現，參照2015版中國藥典優化的樣品制備方法，能夠得到數量較多的桔梗皂苷類成分群。考察甲醇-水、乙腈-水、乙腈-甲酸水及乙腈-磷酸水等流動相體系及不同色譜柱溫與檢測波長條件，發現以乙腈-水作為流動相，在35 ℃時選用210nm檢測波長能夠獲得基線平穩且色譜峰分離度良好、總體質量較高的指紋圖譜。

由結果可知，15批桔梗指紋圖譜相似度在0.927～0.991之間，表明各產地間的栽培及野生桔梗在品質上均有較高的相似性。而聚類分析和主成分分析可進一步將15批桔梗樣品分成不同類別，說明本研究構建的方法不僅可評價桔梗藥材品質的一致性，還可評價桔梗藥材的差異性。OPLS-DA是一種有監督的判別分析統計方法，常用于判別分析樣本的差異性。由實驗結果可知6、9、13、18和20號等色譜峰對不同產地桔梗的品質差異具有較大影響。在本研究中聚類分析與主成分分析將野生樣品與栽培品種分別聚類，說明野生樣品與栽培樣品在成分分布上存在一定差異。根據OPLS-DA分析結果考察各樣品相對峰面積可知，3個野生樣品指紋圖譜6號色譜峰相對峰面積介于0.064%～0.088%，高于栽培品種0.012%～0.056%；13號色譜峰的相對峰面積介于0.059%～0.182%，高于栽培品種的0.018%～0.046%；9號色譜峰相對峰面積介于0.044%～0.056%，高于栽培品種0.011%～0.032%；而15號、18號和20號等色譜峰也表現出相同的趨勢。因此，這些成分色譜峰峰面積的微小差異可能是導致野生樣品與栽培品種聚類不同的主要原因。

總之，本研究采用指紋圖譜結合化學模式識別技術對全國不同產地的桔梗樣品質量進行探討與分析，篩選出造成不同產地桔梗差異的標志性成分，為桔梗的質量控制和后續開發提供了科學參考以及實驗依據。