大別山白及多糖酶法輔助提取及活性研究

朱富成，羅書嵐，鄭 宣，王 芳，何曉梅，鄧 輝，韓邦興

皖西學院 生物與制藥工程學院 安徽省中藥資源保護與利用工程實驗室，六安 237012

大別山中藥資源豐富，是野生中藥材道地產區之一，但中藥資源普查發現，部分野生中藥如白及受全國藥材市場影響，野生資源減少速度逐年增加，為加強保護，皖西學院對大別山野生白及進行保護和研究[1]。白及為蘭科白及屬(BletillaRchb. f.)植物白及Bletillastriata(Thunb. ex A. Murray) Rchb.f.的干燥塊莖[2]，研究表明白及塊莖中含有大量天然水溶性多糖，即白及多糖，是白及的主要藥效成分[3]。白及多糖在醫藥、化妝品及食品領域均有較廣泛的應用，且具有無毒性、生物相容性等特征，使白及多糖備受關注[4]，然而白及多糖的提取率不高，研究不夠系統廣泛，因此如何高效制備白及多糖是該領域急需解決的關鍵問題。

根據已有文獻，目前已有多種新穎提取技術應用于白及多糖提取[5]，如，超聲輔助提取，微波輔助提取，超臨界流體萃取以及紅外輔助提取等方法，每種提取方法在提高提取率的同時也有各自的缺點，例如需要昂貴的精密設備，部分提取方法對多糖結構會造成不同程度影響甚至造成多糖降解[6]。因此，開發簡便高效的提取方法對于白及多糖提取極為重要。生物酶(如纖維素酶、果膠酶等)作為高效催化劑，能作用于植物細胞，增加細胞通透性，促進胞內物質滲漏，研究表明生物酶輔助植物多糖提取可以促進提取率[7]。Xia等[8]利用淀粉酶水解提取枸杞多糖，提取率達到13.2%；Zhu等[9]利用復合酶制劑酶解靈芝提取多糖，提取率達到4.4%；Wang等[10]研究纖維素酶酶解荸薺多糖，提取率為32.3%。目前，利用酶法輔助白及多糖的提取仍然鮮有報道。果膠酶是一種高效生物催化劑，能專一性識別并作用于植物細胞壁中的果膠，增加細胞壁通透性。Song等[11]通過比較幾種酶輔助提取荷蓮葉多糖，發現果膠酶對于多糖的結構最具保護性。基于果膠酶的水解選擇性高，作用專一，可以在保護多糖結構不受破壞的基礎上增加細胞壁的通透性，進而提升多糖的提取率，故在白及多糖的提取研究中具有重要的意義。

本研究通過果膠酶預處理大別山白，結合傳統水提方式提取白及多糖，運用響應面法優化果膠酶預處理，獲得最優白及多糖提取工藝，并進而分析果膠酶輔助提取對多糖天然構象影響，研究其體外抗氧化活性。本研究為酶法輔助提取白及多糖奠定基礎，同時研究結果對產業化應用具有重要參考意義。

1 材料儀器

1.1 材料與試劑

大別山白及(皖西學院植物園栽培)；果膠酶(國藥集團，活力單位50 U/g)；葡萄糖；硫酸；苯酚；無水乙醇；鄰苯三酚(焦性沒食子酸)；鹽酸；鄰二氮菲；三羥甲基氨基甲烷(Tris)；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；硫酸亞鐵；雙氧水；氯化鈉；氯化鉀；磷酸二氫鉀；十二水磷酸氫二鈉；均為市售國產分析純。

1.2 儀器與設備

UV-5500型紫外可見分光光度計(上海元析儀器有限公司)；SU8010發射場掃描電鏡(日立有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用有限公司)。

2 方法

2.1 白及多糖提取

將白及于60 ℃烘干后打粉，并過30目篩，得到固體粉末用石油醚脫脂，并用10 mL/g的95%(V/V)乙醇回流兩次去除寡糖，色素以及其他小分子化合物，經過離心過濾后得到產物進行真空干燥(40 ℃)獲得預處理白及粉。稱量一定量的白及粉，加入果膠酶于一定溫度下預熱一定時間，80 ℃下熱浴10 min變性果膠酶終止酶解，然后熱水浸提3 h，離心后取上清測定多糖得率，多糖得率采用苯酚-硫酸法測定[12]。

2.2 響應面法優化白及多糖提取工藝

設計單因素變量，保持其他條件不變，以果膠酶為酶制劑，分別考察酶解時間、酶解溫度、酶添加量對白及多糖提取率的影響，每個因素平行測定3次，取平均值。

在單因素實驗基礎上，采用Box-Behnken[13]設計原理，以酶解時間(70、80、90 min)、酶解溫度(40、50、60 ℃)、酶添加量(7.5%、10.0%、12.5%)為自變量組合，多糖提取率為響應值進行響應面優化實驗，利用Design-Expert 8.0.6Trial軟件對數據進行分析，得最優酶解提取工藝。

表1 響應面設計因素與水平

2.3 白及多糖純化

將提取的白及多糖溶液進行真空濃縮至原體積的1/3，利用Sevag試劑(氯仿∶丁醇=4∶1，V/V)脫出蛋白[14]，直到脫出后的液體在260 nm和280 nm處吸收值為0，表明核酸和蛋白已經脫完。然后加入無水乙醇至終濃度為80%(V/V)，靜置24 h，離心過濾獲得多糖沉淀并保存。

2.4 白及多糖掃描電鏡分析

參考已有文獻[15]，白及多糖提取液經過冷凍干燥后，利用發射場掃描電鏡(HITACHI SU8010)分析白及多糖凍干粉的的纖維結構，將白及多糖凍干粉均勻鋪展在試樣架上，利用標度尺進行掃描觀察，測定時的放大倍數為400倍，加速電位為5.0 kV。

2.5 白及多糖三級結構分析

根據已有文獻報道方法[16]，利用剛果紅分析方法測定白及多糖構象結構。向2.0 mL的0.2 mg/mL的白及多糖溶液中加入2.0 mL的100 μmol/L剛果紅溶液。向混合溶液中加入梯度的NaOH溶液(0～0.4 mol/L)。利用紫外分光光度計(普析通用TU-1901)對混合溶液進行掃描(250～600 nm)，獲得最大吸收峰。其中不含有白及多糖的剛果紅溶液作為空白對照。

2.6 白及多糖體外抗氧化實驗

2.6.1 羥基自由基清除能力測定

采用Fenton反應體系[17]測定白及多糖對羥自由基的清除能力。在20 mL試管中依次加入0.1 moL/L、pH7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)2 mL、5 mmoL/L鄰二氮菲1 mL、1 mmoL/L硫酸亞鐵1 mL、白及多糖樣品液1 mL、1 mL H2O2(1.0%，V/V)，再用0.1 moL/LPBS定容至10 mL，混合溶液在37 ℃水浴中保溫60 min后，于536 nm處測其吸光值A2。用1 mL蒸餾水代替1.0%的H2O2，于536 nm處測得吸光值為A1。用1 mL蒸餾水代替多糖樣品液，于536 nm處測得吸光值為A0。用2 mL蒸餾水代替多糖樣品液和H2O2為空白對照。經計算獲得羥自由基清除率。

2.6.2 白及多糖對超氧陰離子清除能力測定

采用鄰苯三酚自氧化法[18]測定白及多糖對超氧陰離子的清除率。在20 mL試管中，加入pH8.2、0.1 moL/L Tris-HCL 4.5 mL，再加入4.2 mL蒸餾水，混勻后于25 ℃水浴中保溫20 min，加入預熱的4 mmoL/L鄰苯三酚0.3 mL，混勻后于325 nm處測定吸光值，每過20 s記錄一次吸光值，共記錄3 min，繪制鄰苯三酚自氧化曲線，曲線斜率為A1。用相應體積的蒸餾水代替鄰苯三酚為空白對照管。用1 mL不同濃度的白及多糖樣品液依次代替1 mL蒸餾水，繪制曲線，曲線斜率為A0。經計算獲得超氧陰離子清除率。

2.6.3 白及多糖對DPPH自由基清除能力測定

根據已有文獻[19]，分別取2 mL不同濃度的白及多糖樣品液置于試管中，加入2 mL的DPPH(0.1 mmoL/L)溶液，混合均勻，室溫避光反應30 min，取上清于517 nm處測定吸光值A1。同時測定2 mL乙醇代替2 mL樣品的吸光值A2以及2 mL水代替2 mL DPPH的吸光值A0。按下式計算白及多糖對DPPH的清除率。

3 結果與分析

3.1 單因素對白及多糖提取率的影響

酶的添加量可以決定酶活力，因此對白及多糖的提取具有較大影響，大量的添加酶量可以促進提取率，但是將會增加提取成本，同時大量的酶蛋白存在也將會增加去除的難度，因此加酶量對白及多糖影響十分必要。如圖1A所示，白及多糖提取率隨果膠酶添加量增加而提高，在12.5%～20.0%之間提取率趨于穩定。因此，結合酶制劑的實際情況，為了把成本降到最低，選擇酶添加量為7.5%、10.0%、12.5%三水平進行響應面實驗。

溫度對酶活力影響較大，因此分析溫度對白及多糖酶法提取十分重要。如圖1B所示，白及多糖提取率隨溫度的升高而提高，并在50 ℃時達到最大值，為62.3%。再升高溫度，白及多糖提取率反而下降。這可能是由于溫度過高，果膠酶發生失活，導致酶活性降低，從而提取率下降。綜合考慮，選擇酶解溫度為40、50、60 ℃三水平進行響應面實驗。

酶解時間對白及多糖提取率影響如圖1C所示。白及多糖提取率隨時間的增長而提高，并在80 min到達最大值，為63.0%。酶解時間再加長，白及多糖提取率反而下降，可能是提取時間過長，果膠酶微弱水解白及多糖，致使得率有所降低。綜合考慮，選擇酶解時間為70、80、90 min三水平進行響應面優化實驗。

3.2 基于響應面優化白及多糖的提取

響應面法被廣泛應用于實驗數據的優化處理，該方法具有實驗次數合理，實驗數據可靠等優點，所以本研究根據單因素確定的最佳水平，以白及多糖提取率為響應值，做Box-Behnken響應曲面設計，如表2所示。利用Design Expert 8.0.6軟件對表數據進行分析，得白及多糖提取率(Y)對酶添加量(A)、酶解溫度(B)和酶解時間(C)的二次多項回歸方程：Y=63.77+2.57A+0.92B+1.16C-0.020AB+0.20AC-0.080BC-2.01A2-2.12B2-3.40C2，各因素交互作用結果如圖2所示。

圖1 單因素對白及多糖提取率的影響Fig.1 The effect of single factor on extraction rate of BSP

表2 響應曲面設計及多糖得率

對獲得的相應曲面進行回歸線性系數的顯著性分析，如表3所示，影響因素A影響極顯著；B和C影響顯著，即酶添加量對酶法輔助提取白及多糖提取率有著極其顯著的影響，酶解時間和酶解溫度有著顯著的影響關系，且影響顯著順序為A>C>B。二次項A2、B2、C2影響均為極顯著；交互項中均影響不顯著，這說明白及多糖提取率與各個因素之間不單單是線性關系。此外，試驗整體模型的P= 0.000 7 < 0.01，表明模型達到極顯著水平，失擬項的P=0.656 3>0.05，表明模型失擬不顯著。R2= 0.953 3，說明該模型能解釋95.33%的響應值的變化。由此可見，利用Design-Expert 8.06軟件得到的二元多項回歸方程及其顯著性分析結果準確可靠，可以用此模型分析白及多糖酶提工藝結果。

表3 顯著性及方差分析

通過響應面法分析得到白及多糖酶提工藝的最優條件為：果膠酶添加量12.5%、酶解溫度51.5 ℃、酶解時間81.8 min，但考慮到實際生產條件的操作，可將最佳條件修改為果膠酶添加量12%、酶解溫度52 ℃、酶解時間82 min，在此工藝下，白及多糖提取率為64.8%。采用酶法提取獲得的白及多糖提取率明顯高于利用傳統水提的效率[20]以及微波輔助提取白及多糖的效率[21]。本研究通過響應曲面優化酶法提取白及多糖的得率是目前已報道最高提取率，本方法的開發為白及多糖進一步開發利用及工業化生產提供了良好的依據。

圖2 響應曲面法優化優化白及多糖提取率Fig.2 The response surface method was used to optimize the polysaccharide extraction

3.3 白及多糖構象

考慮到果膠酶可能對白及多糖發生酶催化作用，破壞其天然構象，因此本研究進一步分析了提取的白及多糖的構象。剛果紅試劑可以與多糖的三鏈螺旋結構形成復合物使得最大吸收值會發生紅移，當三鏈螺旋發生解鏈變成單鏈時，剛果紅-多糖復合物的最大吸收值會降低。分析多糖在不同濃度的NaOH溶液中的最大吸收值的變化將有助于分析多糖的構型[15]。如圖3所示，含有白及多糖的剛果紅溶液最大吸收波長比剛果紅空白對照大，表明白及多糖可以使得吸收值發生紅移，表明在498～487 nm波長下白及多糖三股螺旋與剛果紅絡合物形成。當NaOH濃度超過0.4 mol/L后，含有白及多糖的剛果紅溶液最大吸收波長發生明顯的藍移，表明高濃度的NaOH導致白及多糖構象發生去折疊，由三股螺旋演變為單鏈。本研究中的構象分析結果與前人報道通過微波輔助白及多糖提取保持天然構象的結果一致[21]，表明本研究中提取的白及多糖形成了三股螺旋的天然構象，說明本實驗提取的白及多糖構象沒有收到果膠酶破壞。

圖3 白及多糖在不同濃度NaOH種構型轉變分析Fig.3 Conformation transition analysis of BSP at different concentration of NaOH.

3.4 掃描電鏡分析

如圖4所示，本研究中提取的多糖微觀結構在掃描電鏡下呈現一定的孔狀結構，與Qu等[21]報道的微波輔助法提取的多糖相比，電鏡結構更為致密。這一結果進一步說明在酶法輔助提取中果膠酶沒有破壞白及多糖；與微波輔助提取相比，酶法提取對白及多糖的保護性更好。

圖4 白及多糖在掃描電鏡下的微觀結構Fig.4 SEM images of BSP micro-structure

3.5 白及多糖體外抗氧化研究

羥基自由基、DPPH以及超氧陰離子均是活性很強的自由基，可損傷體內多種蛋白質、核酸、脂質等生物大分子，對人體健康不利，因此，對這三種物質的清除可以有效表征其抗氧化活性[22]。本研究采用Fenton反應體系檢測白及多糖對羥自由基的清除能力，結果如圖5A。由圖5A分析可知白及多糖對羥自由基有顯著的清除能力，且表現出良好的劑量依賴關系，清除率隨著白及多糖濃度的增加而升高，白及多糖濃度為15 mg/mL時，清除率為87.6%。本研究白及多糖對DPPH自由基的清除效果如圖5B。分析圖5B可知，白及多糖對DPPH有很強的清除作用，且在1～10 mg/mL的濃度范圍內，白及多糖對DPPH的清除率隨多糖濃度的升高而逐漸增強。當多糖濃度為10 mg/mL時，白及多糖對DPPH自由基的清除率為83.9%。實驗采用鄰苯三酚自氧化法測定白及多糖對超氧陰離子的清除能力，結果如圖5C。由圖分析可知白及多糖對超氧陰離子具有明顯清除作用，且在白及多糖濃度為1～10 mg/mL時，表現出良好的劑量依賴關系，隨著樣品質量濃度升高其清除能力增強，當白及多糖濃度為10 mg/mL時，對超氧陰離子自由基清除率最大，為71.5%。實驗表明本研究的白及多糖對羥自由基、DPPH及超氧陰離子的清除作用具有清除率高、效果穩定的特點。

部分研究報道表明白及多糖可以在較低多糖濃度下(如0.5 mg/mL)展現出較強的抗氧化活性[22]，但本研究結果表明為本實驗所提取白及多糖在10 mg/mL以上濃度時才可以表現出較強的體外抗氧化活性，該結果與Yang等[23]報道表現一致。

4 結論

現有文獻對果膠酶輔助提取白及多糖工藝及其抗氧化活性研究鮮有報道。本研究采用果膠酶輔助法提取白及多糖，采用響應面分析法優化提取工藝。在最優條件下，白及多糖提取率達到64.8%，為目前最高報道量。通過對白及多糖空間構象分析及電鏡觀察表明果膠酶提取對白及多糖具有較好的保護作用。體外性質研究表明，白及多糖對羥自由基、超氧陰離子、DPPH自由基均有很強的清除能力。綜上，本研究首次報道果膠酶輔助提取白及多糖的工藝優化及體外活性，本研究為白及多糖的工業化應用提供了良好的參考條件。

圖5 不同濃度的白及多糖抗氧化性測定Fig.5 Resistance to oxidation analysis of different concentration of BSP