阿膠多肽的高分辨質(zhì)譜鑒定及活性研究

熊雅茹，傅 紅，楊 方

1福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福州 350108；2福州海關(guān)技術(shù)中心；3福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350001；4福州大學(xué) 福建省海洋酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350108

阿膠是我國具有免疫調(diào)節(jié)及改善營養(yǎng)性貧血功能的藥食同源產(chǎn)品，為驢的干燥皮或鮮皮經(jīng)煎煮、濃縮制成的固體膠[1]。性味甘平，具有補(bǔ)血、止血、滋陰潤燥的功效，另可作腫瘤的輔助治療。生物學(xué)的基礎(chǔ)研究證明，蛋白質(zhì)是人體新陳代謝中極為重要的營養(yǎng)物質(zhì)，其降解產(chǎn)物生物活性肽及氨基酸更具廣泛的生理調(diào)節(jié)功能[2,3]。多肽的活性與其氨基酸組成及排列密切相關(guān)。已有研究發(fā)現(xiàn)，疏水性氨基酸對(duì)多肽的生物活性起著關(guān)鍵的作用，N端連接Tyr、Phe等疏水性氨基酸時(shí)更有利于清除自由基[4]，而在抗凝肽C末端上添加疏水性氨基酸會(huì)增強(qiáng)抗凝效果[5]。

阿膠中蛋白含量約為60%～80%，主要由膠原蛋白、血清白蛋白等相對(duì)分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)組成，不易被人體消化吸收。Fu[6]提出“阿膠的主要生物活性物質(zhì)是阿膠含有的膠原蛋白經(jīng)胃蛋白酶、胰蛋白酶降解后的能被機(jī)體吸收且有良好生物相容性的阿膠低肽”的工作假說，并對(duì)阿膠低肽制劑進(jìn)行安全性檢查、藥效學(xué)研究及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。Pang[7]研究發(fā)現(xiàn)阿膠經(jīng)酶解后，相對(duì)分子質(zhì)量減小且具有顯著的補(bǔ)血升白作用。Zhang等[8]通過超高效液相色譜四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別魚膠原蛋白粉的真?zhèn)巍８叻直尜|(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)是近年來用于研究蛋白質(zhì)及多肽的有效方法，能直接對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行準(zhǔn)確快速的分析鑒定[9]。阿膠中的大分子物質(zhì)經(jīng)酶解后得到的多肽及氨基酸類物質(zhì)可能對(duì)人體意義較大，本文在前人研究基礎(chǔ)上，建立了采用UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒定阿膠中肽的方法，并隨機(jī)選擇了鑒定的多肽進(jìn)行抗氧化活性、抗凝血活性等功能試驗(yàn)，為印證阿膠功效提供技術(shù)手段與科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

DIONEX UltiMate 3000超高效液相色譜(美國Dionex公司)；四極桿靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀(Q/Exactive)(美國Thermo Fisher Scientific公司)；全自動(dòng)定氮儀(Kjeltec 8400 Analyzer Unit)；CR21N臺(tái)式冷凍離心機(jī)(日立公司)；酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)；UV-2700紫外-可見分光度計(jì)(日本島津儀器有限公司)。

阿膠(北京同仁堂)；胰蛋白酶(廈門泰京生物技術(shù)有限公司)；胃蛋白酶、N-[3-(2-呋喃基)丙烯酰]-L-苯丙氨酰-甘氨酰-甘氨酸(血管緊張素轉(zhuǎn)換酶，F(xiàn)APGG)、凝血酶、纖維蛋白原(人)、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)(美國Sigma-Aldrich公司)；卡托普利、抗壞血酸VC、過硫酸鉀、鄰二氮菲均為分析純(國藥集團(tuán))；法華林鈉片(Orion Corporation)；ABTS、DPPH(上海麥克林生化科技有限公司)；Tris(生工生物工程股份有限公司)；乙腈、甲酸、甲醇均為色譜純(Thermo Fisher公司)；三氯乙酸(分析純，國藥集團(tuán))；C18Tips(100 μL)(Thermo Scientific公司)；C18SPE固相萃取柱(500 mg/3 mL)(美國Supelco公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)條件

1.2.1 阿膠前處理

燉化：參考文獻(xiàn)[7,10]，取過80目篩的阿膠粉1.5 g，加20倍量去離子水溶解，80 ℃燉化30 min，冷卻至室溫，冷藏過夜。4 ℃、18 000 rpm離心5 min，取上清液用脫脂棉抽濾，濾紙二次過濾，加去離子水補(bǔ)足30 mL，得阿膠燉化液。

酶解：阿膠燉化液30 mL置于小燒杯中，10% NaOH溶液調(diào)節(jié)pH=7.5，分別加入5x105U胰蛋白酶、復(fù)合胰蛋白酶-胃蛋白酶于40 ℃水浴酶解4 h后，沸水浴10 min滅酶活，4 ℃、18 000 rpm離心10 min，取上清液備用[11]。

凈化：C18SPE柱依次用3 mL甲醇、3 mL去離子水活化，取酶解液3 mL過柱，用3 mL甲醇洗脫，重復(fù)3～4次，收集洗脫液，45 ℃氮吹至近干，用3 mL 1%甲酸溶液復(fù)溶，過0.45 μm濾膜[8]，上機(jī)待測(cè)。再用C18Tips柱處理酶解液作對(duì)照試驗(yàn)。

1.2.2 高效液相質(zhì)譜試驗(yàn)條件

色譜條件：Hypersil GOLD UPLC C18色譜柱(2.1×100 mm，1.9 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：A：0.1%甲酸水，B：乙腈，洗脫梯度：0～50 min，乙腈10%→90%；50～55 min，乙腈90%；55～56 min，乙腈90%→10%；56～60 min，乙腈10%；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL。

質(zhì)譜條件：掃描模式：Full MS/dd-MS2，分析時(shí)長60 min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：100～1 500m/z，一級(jí)質(zhì)譜分辨率：70 000 atm/z，AGG target：le6，一級(jí)Maximum IT：100 ms，Number of scan ranges：1，動(dòng)態(tài)排除：40.0 s一次，MS2Activation Type：HCD，Isolation window：0.4m/z，二級(jí)質(zhì)譜分辨率：17 500 atm/z200，Microscans：1，二級(jí)Maximum IT：50 ms，碰撞能量：30 eV，Underfill ratio：0.1%。電噴霧離子源：載氣為高純氮?dú)?純度>99.5%)，鞘氣流速40個(gè)單位(arb)，輔氣流速15個(gè)單位，吹掃氣流速0個(gè)單位；噴霧電壓3.2 kV；碰撞池采用梯度碰撞能量：25%、35%、55%；毛細(xì)管溫度320 ℃，離子透鏡電壓頻率為60，輔氣熱源溫度350 ℃。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

采用MaxQuant(版1.6.1.0)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。搜索針對(duì)包含來自Uniprot的阿膠(uniprot-donkey-hide gelatin.fasta)的蛋白質(zhì)序列(https://www.uniprot.org，2018年11月3日下載)數(shù)據(jù)庫。蛋白FDR設(shè)置為0.01；最小氨基酸長度設(shè)置為3；可變修飾設(shè)為N-Acetyl和Oxidation(M)；固定化修飾設(shè)置為Carbamidomethyl(C)；酶的設(shè)置分別選擇非專一性和專一性，其中專一性酶設(shè)置為胰蛋白酶；最大裂解丟失設(shè)置為2，所有常見的污染物和相反的命中被刪除[12]。

1.2.4 肽段抗氧化活性與抗凝血活性測(cè)定

多肽委托上海波泰生物技術(shù)有限公司合成，通過RPLC-MS檢測(cè)其純度為98%以上。ABTS自由基清除活性參考Wang[13]的方法進(jìn)行測(cè)定，DPPH自由基清除活性參考Liu等[14]的方法進(jìn)行測(cè)定，羥基自由基清除活性參考Xu15]的方法進(jìn)行測(cè)定，抗凝血活性參考Wang[16]的方法進(jìn)行測(cè)定。并用抗壞血酸VC、法華林鈉片做陽性對(duì)照實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理?xiàng)l件優(yōu)化

2.1.1 燉化

燉化和未燉化的阿膠經(jīng)相同復(fù)合酶解過程，UPLC-Q-Exactive三次重復(fù)分析，燉化阿膠檢測(cè)出多肽序列58條，其中有13條能找到對(duì)應(yīng)生物種屬，見表1；未燉化阿膠檢測(cè)出多肽序列50條，有12條能匹配到對(duì)應(yīng)蛋白種屬。燉化阿膠與未燉化阿膠重疊檢測(cè)到的多肽共29條，其中6條能匹配到對(duì)應(yīng)種屬，分別是QASSAVRDSGHR、ANKGFLEEVR、LSSPATLNSR、YEVEINRR、NHQLTVTRGSQK和YENELCLR。燉化阿膠共鑒定出了8種角蛋白、1種凝血酶原、1種纖溶酶原、1種凝膠溶蛋白。而未燉化阿共鑒定出了7種角蛋白、1種凝血酶原、1種纖維蛋白原。

阿膠中由于蛋白質(zhì)比例占80%，故較難消化吸收，這正與中醫(yī)上指出的阿膠“滋膩礙胃”相吻合[6]。對(duì)于消化功能差的病人，單純的口服阿膠不僅不會(huì)達(dá)到應(yīng)有的藥效,反而會(huì)增重胃腸負(fù)擔(dān)。本實(shí)驗(yàn)中燉化阿膠檢測(cè)到更多序列，也從另一方面說明，生活中人們服用阿膠都是經(jīng)過燉煮，高溫使得阿膠中的蛋白進(jìn)一步分解成氨基酸、多肽等易于消化吸收的小分子物質(zhì)，從而發(fā)揮功效。因此后續(xù)優(yōu)化阿膠酶解的實(shí)驗(yàn)中，均使用燉化后阿膠。

表1 燉化阿膠3次酶解活性肽段

2.1.2 酶解

人體消化過程關(guān)鍵酶為胰蛋白酶、胃蛋白酶，本實(shí)驗(yàn)選用胰蛋白酶單獨(dú)酶解、胰蛋白酶-胃蛋白酶復(fù)合酶解兩種方式模擬消化過程對(duì)燉化阿膠進(jìn)行酶解優(yōu)化。結(jié)果表明，單獨(dú)酶解效果優(yōu)于復(fù)合酶解效果，胰蛋白酶單獨(dú)酶解后3次重復(fù)分析共檢測(cè)到了63條肽段，其中19條具有明確蛋白來源，如表2所示；而復(fù)合酶解檢測(cè)到58條序列，12條具有明確蛋白來源。

經(jīng)酶解優(yōu)化后的檢測(cè)結(jié)果明顯更豐富，檢測(cè)到了更多種類的蛋白，其活性也多種多樣。如檢測(cè)到的載脂蛋白具有膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，參與脂蛋白代謝等生物過程；激肽原具有半胱氨酸型內(nèi)肽酶抑制劑活性的分子功能，參與炎癥反應(yīng)等生物過程。檢測(cè)的阿膠多肽主要集中在6～25個(gè)氨基酸之間，最長的多肽是TTTIRQFTSSSSIKGSSGLGGGSSR，存在于Rattusnorvegicus、Pantroglodytes當(dāng)中，參與各種皮膚附件的形成和維持，最短的肽段有TEELNR、AAPSRR、PGQSPR等。綜合分析，胰蛋白酶單獨(dú)酶解燉化阿膠效果更好。

表2 阿膠胰蛋白酶3次酶解活性肽段

2.2 凈化條件選擇

C18對(duì)非極性、弱極性以及中等極性化合物具有廣泛的保留，采用C18SPE可以較好的保留胰蛋白酶酶切后的多肽，而將其他鹽類物質(zhì)脫除，適用于多肽質(zhì)譜鑒定的前處理[17]。本文比較了C18Tips、C18SPE兩種凈化材料的效果，對(duì)比3次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果表明阿膠酶解產(chǎn)物經(jīng)C18SPE處理后比C18Tips處理后多得到27條肽段，且多來源于酶原、角蛋白等，兩種固相萃取柱的結(jié)果交叉匹配到5條序列，這可能是因?yàn)镃18Tips過負(fù)載造成的，本文最終采用C18SPE凈化。經(jīng)優(yōu)化試驗(yàn)后，液質(zhì)聯(lián)用分析阿膠燉化液酶解產(chǎn)物的總離子流圖如圖1所示。

2.4 阿膠多肽功能的篩選

阿膠具有補(bǔ)血、止血、改善鈣代謝平衡、調(diào)節(jié)免疫功能、抗疲勞等藥理作用[18]。動(dòng)物類中藥的有效成分以蛋白多肽為主，因此活性蛋白多肽具有重要的醫(yī)療保健價(jià)值[23]。近年研究表明，除營養(yǎng)功能外，蛋白質(zhì)酶解產(chǎn)物中的一些短肽還具有廣泛的生理調(diào)節(jié)功能，如促進(jìn)鈣吸收、降血壓、降低膽固醉、免疫調(diào)節(jié)等。以膠原的適度降解產(chǎn)物為原料，通過不同種類的酶和催化方式，可制備具高抗氧化性的膠原肽[19]；Yao等[20]研究發(fā)現(xiàn)阿膠對(duì)休克時(shí)血液粘滯性的增加有明顯抑制作用，一定程度維持了有效循環(huán)血量，利于微循環(huán)恢復(fù)正常。

圖1 阿膠胰蛋白酶酶解產(chǎn)物的總離子流譜圖Fig.1 Total ion flow spectrogram of trypticase of donkey-hide gelatin

有研究報(bào)道，疏水性氨基酸對(duì)多肽的抗氧化性起著關(guān)鍵作用，疏水性氨基酸含量越高，其抗氧化能力越強(qiáng)[14]。目前一些肽類化合物已被發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗凝血活性，部分活性肽的結(jié)構(gòu)也得到進(jìn)一步的鑒定。有研究實(shí)驗(yàn)表明多肽C末端上的氨基酸疏水性越強(qiáng)，其抗凝血效果越好[5]。

UPLC-Q-Exactive四級(jí)桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜連用儀分析，將本實(shí)驗(yàn)所得肽段在UniProt上進(jìn)行BLAST序列對(duì)比，挑選C端具有強(qiáng)疏水性氨基酸如Leu(L)、Phe(F)、Tyr(Y)或參與纖維蛋白溶解等生物過程的肽段做體外抗凝血活性實(shí)驗(yàn)，挑選N末端具有疏水性氨基酸或序列中疏水氨基酸比例較高的肽段做體外抗氧化活性實(shí)驗(yàn)[21]。從三次重復(fù)檢測(cè)結(jié)果中篩選并驗(yàn)證9條肽段活性，結(jié)果如下表3所示。

表3 肽段序列分析

2.5 阿膠多肽的體外活性實(shí)驗(yàn)

2.5.1 ABTS自由基清除活性

由圖2可知，9條肽段均具有ABTS自由基清除活性。在0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)，多肽濃度升高，清除作用漸強(qiáng)。ABTS自由基清除能力從大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、LYEEEIR、LASYLDK、MDNPDTFYSLKYQIK、ANKGFLEEVR、QHASQVLIRR、FAAFIDK、IAVGGFR。其中多肽YQCLKGTGK的ABTS自由基清除力最高，2.5 mg/mL時(shí)為82.41%±0.41%，0.5 mg/mL時(shí)清除率已經(jīng)遠(yuǎn)大于50%。

2.5.2 DPPH自由基清除活性

由結(jié)果可知，9條肽段均具有DPPH自由基清除活性，在0.5～2.5 mg/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系。當(dāng)多肽溶液濃度為2.5 mg/mL 時(shí)，DPPH自由基清除能力從大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、QHASQVLIRR、IAVGGFR、LASYLDK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR、LYEEEIR。其中多肽YQCLKGTGK的DPPH自由基清除力最高，2.5 mg/mL時(shí)為64.74%±0.36%，半抑制濃度(IC50值)遠(yuǎn)小于0.5 mg/mL，詳細(xì)結(jié)果見圖3。

圖2 多肽及陽性對(duì)照組對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig.2 Scavenging ability of peptides and positive control group to ABTS free radicals

圖3 多肽及陽性對(duì)照組對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.3 Scavenging ability of peptides and positive control group to DPPH free radicals

2.5.3 羥基自由基清除活性

結(jié)果顯示，5條多肽表現(xiàn)出羥基自由基清除活性，且隨濃度升高，清除作用越強(qiáng)。濃度為2.5 mg/mL時(shí)，羥基自由基清除能力從大到小依次是YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK、MDNPDTFYSLKYQIK、FAAFIDK、ANKGFLEEVR。多肽YQCLKGTGK的半抑制濃度(IC50值)遠(yuǎn)小于0.5 mg/mL，2.5 mg/mL時(shí)羥基自由基清除率高達(dá)95.62%±0.20%。未表現(xiàn)出羥基自由基清除活性的肽段有QHASQVLIRR、IAVGGFR、LASYLDK和LYEEEIR，具體結(jié)果見圖4。

圖4 多肽及陽性對(duì)照組對(duì)羥基自由基的清除能力Fig.4 Scavenging ability of peptides and positive control group to hydroxyl free radicals

2.5.4 抗凝血活性

結(jié)果表明，5條多肽表現(xiàn)出抗凝血活性，隨著濃度升高，對(duì)凝血酶抑制活性越強(qiáng)。濃度為2.5 mg/mL時(shí)，抗凝血活性從大到小依次是MDNPDTFYSLKYQIK、QHASQVLIRR、LYEEEIR、LASYLDK、CTTPPPSSGPKYQCLK，見圖5。多肽MDNPDTFYSLKYQIK的半抑制濃度(IC50值)約為1.9 mg/mL，2.5 mg/mL時(shí)抗凝血活性高達(dá)80.78%±0.22%。未表現(xiàn)出抗凝血活性活性的肽段有YQCLKGTGK、ANKGFLEEVR、FAAFIDK和IAVGGFR。

圖5 多肽及陽性對(duì)照組的抗凝血活性Fig.5 Anticoagulant activity of peptides and positive control group

2.6 多肽活性與結(jié)構(gòu)分析

選出的9條多肽都具有一定強(qiáng)度的抗氧化活性，對(duì)比陽性對(duì)照組的L-抗壞血酸結(jié)果，抗氧化能力較強(qiáng)的序列為YQCLKGTGK和CTTPPPSSGPKYQCLK。肽段CTTPPPSSGPKYQCLK的C末端是脂肪族氨基酸Leu(L)、堿性氨基酸Lys(K)，序列中含有大量的疏水性氨基酸Pro(P)、Lys(K)、Tyr(Y)。肽段YQCLKGTGK 的N末端是芳香族氨基酸酪氨酸Try(Y)，C末端是堿性氨基酸Lys(K)，序列中含有疏水性氨基酸Leu(L)、Lys(K)，且對(duì)3類自由基清除能力最強(qiáng)。IAVGGFR、LASYLDK、LYEEEIR的N末端是疏水性氨基酸亮氨酸Leu(L)，且疏水性氨基酸含量均達(dá)到40.00%以上，表明多肽的抗氧化活性與N末端氨基酸的組成以及多肽鏈?zhǔn)杷被岬恼急扔幸欢?lián)系[22]。將抗氧化活性最強(qiáng)的多肽YQCLKGTGK、CTTPPPSSGPKYQCLK在Uniprot上進(jìn)行蛋白質(zhì) Blast，所得結(jié)果見圖6，該多肽存在于Plasminogen第281、289、268～284位，其生物詳細(xì)信息見表4。

表4 肽段MaxQuant分析結(jié)果

結(jié)果顯示，具有抗凝血活性的5條多肽分別是MDNPDTFYSLKYQIK、QHASQVLIRR、LYEEEIR、LASYLDK和CTTPPPSSGPKYQCLK。這可能和其C端均連接了2個(gè)或以上數(shù)量的疏水氨基酸有關(guān)，此前有研究實(shí)驗(yàn)表明在抗凝肽的C-端添加上疏水性越強(qiáng)的氨基酸，其抗凝血效果得到顯著提高[5]，且MDNPDTFYSLKYQIK、LYEEEIR、LASYLDK和CTTPPPSSGPKYQCLK 4條多肽中疏水氨基酸占比均40%以上，對(duì)比陽性對(duì)照組得到的結(jié)果相一致。在UniProt中對(duì)這兩條肽段進(jìn)行BLAST搜索，可知MDNPDTFYSLKYQIK具有內(nèi)肽酶活性負(fù)調(diào)節(jié)等功能，QHASQVLIRR具有刺激纖維蛋白溶解等功能。

圖6 Plasminogen氨基酸排列圖Fig.6 Amino acid alignment of plasminogen

3 結(jié)論

本文用酶解阿膠燉化液聯(lián)合UPLC-Q-Exactive四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀分析的方式，研究阿膠中多肽結(jié)構(gòu)與其對(duì)應(yīng)生物活性的關(guān)系。3次重復(fù)質(zhì)譜鑒定，檢測(cè)出63條多肽，其中有19條明確生物來源，分子功能與生物活性呈多樣性。根據(jù)分析結(jié)果與多肽活性構(gòu)效關(guān)系，挑選出9條阿膠多肽進(jìn)行體外活性測(cè)定，結(jié)果顯示9條多肽均具有抗氧化活性，5條序列具有抗凝血活性。多肽的抗氧化、抗凝血活性是多種因素共同作用的結(jié)果，其中末端氨基酸的種類，肽鏈中氨基酸的組成以及肽鏈長度對(duì)肽段活性均有一定的影響，這一結(jié)果為揭示阿膠多肽結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。