不同品種黃麻葉多糖的理化特征及抗氧化活性研究

馮湘沅，成莉鳳，謝純良，楊 琦，劉志遠，鄭 科，段盛文，彭源德

中國農業科學院麻類研究所，長沙 410205

黃麻屬于一年生草本椴樹科植物，原產于東南亞，約有100多個品種[1]，其葉的形狀為卵圓狀披針形或披針形，含有黃麻甙、β-谷甾醇、β-谷甾醇D-葡萄糖甙、黃麻酮及單糖類組分等化學成分。據《本草綱目拾遺》、《陸川本草》等記載：具有理氣止血、排膿生肌等功能[2]。國內外學者不斷地深入研究黃麻品種、營養等，Li等[3]進行了菜用黃麻嫩梢營養與分析研究，Lin等[4]進行了菜用黃麻新品種福農1號的選育研究；Phuwapraisirisan等[5]研究了長蒴黃麻苷A、B的降血糖作用，Yamazaki等[6]研究了長蒴黃麻葉水提物的高粘性水膠體的成分等，但是，針對不同品種黃麻葉多糖的結構、分子量以及抗氧化活性等系統研究鮮見報道。

人體在生命活動代謝過程中會不斷地產生自由基，而過量自由基與許多疾病的發生有著密不可分的聯系，如：羥基自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基等異常過多能破壞細胞膜，干擾細胞的新陳代謝；加快肌體衰老，引發心腦血管疾??；侵蝕機體組織，導致各種非菌性炎癥等，對人體健康造成嚴重的影響[7,8]。多糖具有抗炎、抗衰老、抗凝血、抗潰瘍、抗腫瘤及促進免疫等功效[9]。近些年來，隨著人們對身體健康保護意識逐漸增強，多糖作為保健品的主要成分備受人們青睞。

由于多糖具有大量的羥基，遇水容易溶出，而乙醇又能使多糖沉淀，實驗安全且易操作，故本文采用熱水浸提-醇沉法提取不同品種黃麻葉中多糖，并針對多糖的含量、結構、分子量、單糖組成及抗氧化活性進行比較分析，旨在為黃麻的種植及功能性保健產品的綜合開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

原料：采摘于中國農業科學院麻類研究所長沙實驗基地種植的不同品種黃麻葉(苗后天數均為28天)，分別為：1.圓果種黃麻葉(品系名稱：英德深紅皮，特征為紅莖、綠葉、葉脈較稀、無光澤)；2.長果種黃麻葉(品系名稱：中黃麻4號，特征為綠莖、綠葉、葉脈較密、有光澤)。

1.2 主要儀器與試劑

儀器：高效液相色譜儀(Dionex Ultimate 3000)，色譜柱(Xtimate C184.6×200 mm，5 μm)，粉碎機(天津泰斯特儀器有限公司，FZ102)，恒溫振蕩器(金壇市天竟實驗儀器廠，SHZ-82型)，全波長酶標分析儀(Thermo Fisher，multiskan Go型)，凝膠滲透色譜儀(Agilent 1100，Agilent Technologies，USA)，Nicolet iS 10光譜儀(Thermo Fisher Scientific，USA)，離心機(SiGmA，3k15型)。

試劑：無水乙醇、FeSO4、H2O2、Tris、二苯代苦味酰肼自由基、水楊酸、鄰苯三酚、L-抗壞血酸(VC)、三氯甲烷(國藥集團化學試劑有限公司產品，分析純)；甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、氨基半乳糖、葡萄糖(美國Sigma公司)。

1.3 多糖樣品的制備[10]

將黃麻葉洗凈，50 ℃烘干，粉碎，過45目篩(平均粒徑為0.35±0.02 mm)；精確稱取5.0 g黃麻葉粉末于500 mL三角瓶中，加150 mL超純水，于60 ℃、150 rpm恒溫水浴振蕩器加熱振蕩5 h后，冷卻至室溫；再移入離心管于8 000 rpm離心10 min，收集上清液，即得提取液。

取100 mL上清液加入400 mL無水乙醇，攪拌，靜置，棄溶液，收集黃色絮狀物，干燥得多糖固形物。

樣品：精確稱取一定量的多糖固形物分別配制成所需不同濃度溶液。

1.4 測定方法

1.4.1 多糖含量測定

多糖含量參照Yu等[11]采用的硫酸-苯酚法測定進行。

標準溶液配制：精確稱取100 mg葡萄糖(105 ℃干燥恒重)于100 mL容量瓶中溶解，定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 mg/mL葡萄糖標準溶液，適度稀釋不同濃度溶液用作標準曲線測定。

提取液多糖含量的測定方法同上述標準溶液的測定。

多糖濃度(mg/mL)按葡萄糖標準曲線回歸方程進行計算；多糖質量(mg)=多糖濃度×稀釋倍數×總體積；多糖含量(mg/g)=多糖質量/粉末質量。

1.4.2 FT-IR光譜分析

取1mg樣品與100 mg KBr(干燥)混合，放入瑪瑙研缽中研磨10 min后，壓入盤中，用Nicolet iS 10光譜儀在4 000～400 cm-1范圍進行掃描。

1.4.3 單糖組成

1.4.3.1 HPLC檢測條件

1.4.3.2 衍生方法

標準品溶液配制：精密稱取適量甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基葡萄糖、葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖對照品，加水溶解稀釋至每1 mL中各含50 μg的混合標準對照溶液。

標準品溶液衍生步驟：精確吸取250 μL標準品溶液到5 mL EP管中，加入250 μL NaOH(0.6 mol/L)，500 μL PMP(0.4 mol/L)-甲醇，70 ℃反應1 h，冷卻10 min；加入500 μL HCl(0.3 mol/L)中和，再加入1 mL三氯甲烷漩渦1 min，3 000 rpm離心10 min，收集上清(萃取重復3次)，上清液用于HPLC分析。

樣品水解：精確稱取適量樣品至5 mL安培瓶中，加入2.0 mL TFA(2 mol/L)于5 mL安瓿中，封管，110 ℃酸解8 h，取出揮干TFA，加2.0 mL水復溶。

樣品溶液衍生：參照標準品溶液衍生，將樣品溶液衍生后稀釋10倍用于HPLC分析。

1.4.4 多糖分子量的測定

使用PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝膠滲透色譜儀測定多糖分子量。

隨著我國風電等間歇性電源的大規模發展，電力系統調峰需求將逐漸增大。天然氣發電機組啟動迅速，調節方便，具有較強的調峰能力，對電力系統的安全穩定運行可以起到重要的保障作用。

1.5 抗氧化活性測定

1.5.1 自由基清除率的測定

羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基的清除率均分別參照Huang等[12]測定中采用的水楊酸法、二苯代苦味酰肼自由基、鄰苯三酚法法進行，同時以VC(強抗氧化劑)作為對照。

1.5.2 EC50值

EC50值是指自由基清除率為50%時所需樣品的濃度，該值根據回歸方程計算得出。EC50值越低，抗氧化活性越高[13]。

1.6 數據處理方法

實驗數據均取平行3次測量值的平均值和標準偏差，同時采用Excel軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 多糖的理化特征分析

2.1.1 多糖含量測定

采用苯酚-硫酸法對不同濃度葡萄糖溶液測定(圖1)，以濃度(x)為橫坐標和吸光度(y)為縱坐標繪制標準曲線回歸方程為y=11.511x+0.033 3，R2=0.996 6。根據標準曲線回歸方程計算出的圓果種黃麻葉、長果種黃麻葉提取液中多糖含量分別為80.92、60.77 mg/g，圓果種黃麻葉多糖含量高于長果種黃麻葉多糖。

2.1.2 FT-IR光譜分析

如圖2所示，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖分別在3 283 cm-1和3 264 cm-1處出現的吸收峰是屬于多糖分子內或分子間-OH的拉伸振動特征，這主要是由多糖苷的延伸振動引起的；兩者同時在1 403 cm-1處出現的吸收峰表示為C-O伸縮振動；分別在1 036 cm-1和1 026 cm-1處出現的吸收峰，表示是由消旋引起的吡喃糖環的拉伸振動[14]。這些吸收峰說明兩種黃麻葉多糖通過FT-IR光譜在4 000～400 cm-1下測定具有非常相似的吸收帶，且含有葡聚糖的典型紅外光譜信號，均屬于多糖類物質的典型特征。

圖2 不同品種黃麻葉多糖的紅外光譜圖Fig.2 Infrared spectra of polysaccharides from jute leaves of different varieties 注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.3 分子量測定

經PL aquagel-OH Mixed 8 mm凝膠滲透色譜分析儀檢測獲得不同品種黃麻葉多糖GPC色譜圖見圖3，圓果種黃麻葉多糖出峰保留時間分別在9.791、12.842、15.618 min時，峰面積占比分別為1.88%、1.84%、96.28%；長果種黃麻葉多糖出峰保留時間分別在9.784、12.823、15.650 min時，峰面積占比分別為3.55%、4.46%、91.99%，根據保留時間、峰面積換算，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖的平均摩爾分子量分別為59.87 kDa和102.54 kDa。結果表明，兩種不同黃麻葉多糖樣品的出峰保留時間、峰面積占比存在著差異，說明分子量有差別。

圖3 不同品種黃麻葉多糖的GPC色譜圖Fig.3 GPC chromatogram of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.1.4 單糖組成分析

樣品經水解衍生、HPLC法分析檢測，對照標準品獲得水解產物的單糖組成色譜圖以及數據由圖4、表1可知：除氨基半乳糖外，兩種樣品多糖均含有甘露糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、阿拉伯糖、巖藻糖等11種單糖成分。其中圓果種黃麻葉多糖中含量最多的為半乳糖(質量分數為27.06%)，其次甘露糖(質量分數為18.48%)，但氨基半乳糖含量未檢測到；而長果種黃麻葉多糖中含量最高的為葡萄糖(質量分數為44.55%)，其次半乳糖(質量分數為20.24%)，但出現有氨基半乳糖(質量分數為0.03%)，含量最低；圓果種黃麻葉多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分別較長果種黃麻葉多糖高6.47%和0.50%。

圖4 不同品種黃麻葉多糖的單糖組成色譜圖Fig.4 Chromatogram of monosaccharide compositions of polysaccharides from jute leaves of different varieties注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長果種黃麻葉多糖；S.標準品：1.甘露糖；2.核糖；3.鼠李糖；4.葡萄糖醛酸；5.半乳糖醛酸；6.氨基葡萄糖；7.葡萄糖；8.氨基半乳糖；9.半乳糖；10.木糖；11.阿拉伯糖；12.巖藻糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius;S.Standards:1.Mannose;2.Ribose;3.Rhamnose;4.Glucuronic acid;5.Galacturonic acid;6.Glucosamine;7.Glucose;8.Aminogalactose;9.Galactose;10.Xylose;11.Arabinose;12.Fucose.

表1 不同品種黃麻葉多糖的單糖組成測定

2.2 抗氧化活性測定

2.2.1 清除羥基自由基能力

由圖5可知，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖對羥基自由基清除率均隨濃度的增加而增大，但圓果種黃麻葉多糖的羥基自由基清除率均高于長果種黃麻葉多糖。如：當多糖濃度為1 mg/mL時，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖對羥基自由基清除率分別為46.23%、41.81%，圓果種黃麻葉多糖的清除率較長果種黃麻葉多糖提高4.42%。

EC50值計算結果由表2可看出，圓果種黃麻葉多糖對羥基自由基清除能力的EC50值(1.14 mg/mL)小于長果種黃麻葉多糖的EC50值(1.32 mg/mL)。從多糖濃度在0.2～1.4 mg/mL范圍來看，圓果種黃麻葉多糖對羥基自由基清除能力稍強于長果種黃麻葉多糖，但兩者多糖其清除能力均較VC(強抗氧化劑)弱。

圖5 不同品種黃麻葉多糖和VC對羥基自由基清除能力Fig.5 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on hydroxyl free radicals注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

2.2.2 清除DPPH自由基能力

從圖6可得，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖和VC對DPPH自由基清除率分別由0.2 mg/mL時36.18%、27.2%、88.58%增加到1mg/mL時67.30%、61.11%、93.25%，其清除率均與濃度呈正相關。從整體變化規律來看，其清除率都呈上升趨勢，但VC其清除率最高，圓果種黃麻葉多糖次之，長果種黃麻葉多糖最低。

EC50值結果(表2)表明，圓果種黃麻葉多糖對DPPH自由基清除能力(EC50值0.43 mg/mL)較長果種黃麻葉多糖(EC50值0.69 mg/mL)強。

2.2.3 清除超氧陰離子自由基能力

由圖7可看出，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖對超氧陰離子自由基清除率均隨濃度的增加而逐漸增強，但VC其清除率增大趨勢較緩。當濃度為1mg/mL時，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖和VC對其清除率分別為75.02%、66.81%、90.11%。

圖6 不同品種黃麻葉多糖和VC對DPPH自由基清除能力Fig.6 The scavenging ability of polysaccharides from jute leaves of different varieties and VC on DPPH free radicals 注：A.圓果種黃麻葉多糖；B.長果種黃麻葉多糖。Note:A.Polysaccharides of C.capsularis;B.Polysaccharides of C.olitorius.

EC50值(表2)結果顯示，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖對超氧陰離子自由基清除能力的EC50值分別為0.37、0.57 mg/mL，結果表明，圓果種黃麻葉多糖對超氧陰離子自由基清除能力明顯優于長果種黃麻葉多糖，但與VC對照相比，兩者多糖對其清除能力均較弱。

3 討論與結論

本研究是在固液比1∶30、溫度60 ℃、轉速150 rpm恒溫水浴振蕩器加熱振蕩5 h條件下，利用醇沉法對不同品種黃麻葉(苗后天數均為28天)提取多糖，采用硫酸-苯酚法測得圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖的含量分別為80.92、60.77 mg/g；凝膠滲透色譜檢測相應平均摩爾分子量分別為59.87、102.54 kDa；紅外光譜顯示圓果種黃麻葉和長果種黃麻葉的多糖結構出現有極其相似的吸收峰，均具有多糖類物質的典型結構；水解衍生-HPLC法測得圓果種黃麻葉多糖和長果種黃麻葉多糖均含有半乳糖、甘露糖、核糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸等11種單糖，其中圓果種黃麻葉多糖是以半乳糖(質量分數為27.06%)、甘露糖(質量分數為18.48%)為主要單糖成分；長果種黃麻葉多糖則是以葡萄糖(質量分數為44.55%)、半乳糖(質量分數為20.24%)為主要單糖成分，但圓果種黃麻葉多糖中葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸的含量分別較長果種黃麻葉多糖高6.47%和0.50%。通過結果表明，圓果種黃麻葉多糖的含量高于長果種黃麻葉多糖，兩種多糖理化特征存在著差異，這些差異的產生可能主要與原料品種有關，說明不同品種黃麻葉中含有不同的多糖類物質。

多糖作為提取物，許多研究均表明多糖具有較強的抗氧化活性，如：Bi等[15]、Jiao等[16]及Ni等[17]分別研究報道了真菌多糖、甜茶葉多糖及黃芪多糖的抗氧化活性，在質量濃度1mg/mL時，其相應DPPH自由基清除率為55%、63.7%和72.9%。而本研究結果顯示，圓果種黃麻葉多糖和長果種黃麻葉多糖在濃度1mg/mL時，其DPPH自由基清除率分別為67.30%和61.11%，與文獻[15,17]相比，圓果種葉多糖的DPPH自由基清除能力高于真菌多糖和甜茶葉多糖，但較黃芪多糖低。本研究中的抗氧化活性結果顯示，圓果種黃麻葉多糖、長果種黃麻葉多糖均能對羥基自由基、DPPH自由基、超氧陰離子自由基有著不同程度的清除效果，且清除率與多糖濃度劑量呈正相關，但圓果種黃麻葉多糖對自由基清除能力的EC50值均低于長果種黃麻葉多糖。表明兩種黃麻葉多糖具有一定的抗氧化能力，是有待于開發的抗氧化活性物質。

在本研究條件下，圓果種黃麻葉多糖抗氧化活性較長果種黃麻葉多糖強，可能與多糖的糖醛酸類單糖含量高低以及分子量大小有關，這一結論與文獻[18,20]報道相吻合，可為黃麻葉多糖的深入研究和資源開發提供一定的參考，但針對有效成分的最佳提取方法與種植最適采摘時間的關系等有待于進一步探討。