殼寡糖對葡聚糖硫酸鈉誘導結腸炎小鼠的保護作用

陳 爽，王 斌，徐 穎，夏文水*

1江南大學食品學院 食品科學與技術國家重點實驗室；2江蘇省食品安全與質量控制協同創新中心，無錫 214122

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis，UC)和克羅恩癥(Crohn’s disease，CD)。潰瘍性結腸炎，于1875年由Wilk和Moxon發現，1903年由Boas和Wilk定義，1905年被WHO正式定為一種特殊的臨床病癥[1]。潰瘍性結腸炎，是一種非特異性結腸炎，主要位于大腸中的乙狀結腸和直腸，病灶連續性分布于黏膜及黏膜下層，并緩慢反復發作，也有少數急性發病，主要表現為腹痛、腹瀉和糞便粘稠帶膿血[2]，還伴隨有多種腸外癥狀[3]。潰瘍性結腸炎確切的病因和發病機制目前仍不明確，普遍認為與感染、免疫系統失常、遺傳敏感性、環境、精神、菌群失調等多種因素有關[4，5]。其在西方國家十分常見，每105人中就有10～20人患病，其中北美和西歐發病率更高[6]。而近年來我國的UC患病率也呈上升趨勢。目前，治療結腸炎已有5-氨基水楊酸類(柳氮磺吡啶)、免疫抑制劑等對癥藥物，但具有一定副作用，因此尋找安全藥物成為研究熱點[7]。

殼寡糖(chitooligosaccharides，COS)，由殼聚糖(chitosan，CS)水解產生，聚合度2～20，且平均分子量小于3 900 Da[8-10]。其分子量小、易溶于水，可被生物機體直接吸收，具有減脂、降糖、抑菌、抗癌、抗炎等生物活性，且無毒副作用，可廣泛應用于醫藥、化妝品、食品和農業等多個領域[11,12]。其中殼聚糖可由世界上含量僅次于纖維素的第二豐富的聚合物——甲殼素(常見于甲殼類動物殼，昆蟲表皮和真菌細胞壁[10,13])脫乙?；@得。目前，已有一些殼寡糖作用腸炎的研究，如Yang等[14]發現殼寡糖可通過AMPK、NF-κB實現對結腸炎的保護作用。但是在應用濃度上明顯偏高(一般為500 mg/kg，換算為人體劑量約3.6 g)，遠遠超過國家推薦攝入劑量0.5 g/天(參見《關于批準殼寡糖等6種新食品原料的公告(2014年第6號)》，換算成小鼠劑量為70 mg/kg)。而Yousef[15]利用乙酸滴注結腸炎模型、腸上皮細胞試驗等發現20 mg/kg劑量下的殼寡糖也能對腸炎起到保護作用。因此本文主要通過 3% DSS 飲用水誘導結腸炎小鼠模型，驗證殼寡糖在不同劑量下(70和140 mg/kg)對結腸炎的干預情況，探究殼寡糖在調節小鼠結腸炎癥和生理狀態上的作用，為進一步研究殼寡糖對DSS誘導結腸炎小鼠的保護作用提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

葡聚糖硫酸鈉(DSS，相對分子量36 000～50 000 Da，美國MP生物醫學公司)；殼寡糖(相對分子量約為1 299 Da，脫乙酰度85%，浙江金殼生物化學有限公司)；柳氮磺吡啶(美國Sigma公司，批號S0883-10G)；隱血測試盒、髓過氧化物酶(MPO)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；IL-6、TNF-αELISA檢測試劑盒(美國R&D公司)；蘇木素伊紅(HE染色)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

WTL-6K迷你離心機(湖南湘儀離心機儀器有限公司)；4K15冷凍型大容量離心機(德國Sigma公司)；UV-1800型紫外可見分光光度計(日本島津公司)；M5酶標儀(美國Molecular Devices公司)；PM2245徠卡手動轉輪切片機(德國徠卡公司)；ECLIPSE尼康顯微鏡(日本尼康公司)；DK0-8D恒溫水浴鍋(金壇市新航儀器廠)；超低溫冷凍冰箱(日本三洋電機公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗設計

野生型SPF級的6～8周齡雄性C57BL/6小鼠50只，體重在18～20 g，購買于斯貝福(北京)實驗動物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK(京)2019-0010，飼養于江南大學實驗動物研究中心，動物使用許可證號：SYXK(蘇)2016-0045。保持室溫20～24 ℃，濕度60%～70%，人工光照12 h/天，實驗開始前適應性喂養1周，自由飲食。

將小鼠隨機分為5組，10只/組，除空白組外，各組連續飲用3% DSS 7天建立潰瘍性結腸炎模型，同時給予相應藥物治療：DSS組(無菌水，0.2 mL，灌胃)；陽性組(柳氮磺吡啶50 mg/kg，0.2 mL，灌胃)；殼寡糖低劑量組(殼寡糖70 mg/kg，0.2 mL，灌胃)；殼寡糖高劑量組(殼寡糖140 mg/kg，0.2 mL，灌胃)。所有藥物現配現用，小鼠自由采食。第8天，所有小鼠眼球取血，3 000 rpm離心10 min取血清-80 ℃保存。斷頸處死小鼠，迅速剪開腹腔，取出整段結腸，測定長度，縱向剪開，分離結腸內容物，用預冷PBS清洗，定性濾紙干燥，稱重。留取相同部位用4%多聚甲醛固定，做病理組織學，剩下部分液氮速凍，轉存-80 ℃冰箱待用。

1.2.2 疾病活動指數(disease activity index，DAI)和組織病理學評分

每日觀察小鼠進食飲水、毛發等生理狀態和體重、糞便、隱血等情況，計算體重變化率和DAI總分。參考Cooper[16]的DAI評分標準，見表1。

體重變化率=實驗當天體重/起始體重×100%

DAI=大便性狀+體重丟失+便血情況

結腸經4%多聚甲醛固定，脫水透明，石蠟包埋后，切片、脫蠟和HE染色，透明并封片，鏡檢觀察。病理組織學評分標準則參照Cooper標準[16]，具體評分標準為：0正常腸黏膜；1黏膜層輕度炎癥和水腫，基底部1/3隱窩消失；2黏膜層中度炎癥，基底部2/3隱窩消失；3黏膜層中度炎癥，隱窩完全消失，但上皮層尚完整；4粘膜層、粘膜下層、肌層重度炎癥，隱窩和上皮層消失。

表1 DAI評分標準

1.2.3 結腸髓過氧化物酶(MPO)活性及IL-6和TNF-α含量的檢測

結腸MPO活性按照南京建成試劑盒說明書進行測定。結腸IL-6和TNF-α含量檢測按照R&D試劑盒說明書進行測定。

1.3 統計學處理

2 結果

2.1 小鼠體重和DAI變化

如圖1所示，實驗前各組間小鼠體重無顯著差異(P>0.05)，隨著DSS的飲用，除空白組體重每天緩慢增長外，所有飲用DSS水的小鼠體重呈現下降趨勢，模型組小鼠從第6天開始體重變化率與空白組相比具有顯著的統計學差異(P<0.05)，第7天開始較空白組具有極顯著差異(P<0.01)。殼寡糖低、高劑量組和陽性藥柳氮磺吡啶組，相比模型組，體重下降程度有所減小，但無顯著性差異(P>0.05)。其中殼寡糖低、高劑量組后期趨勢近乎重合，且相比陽性組，體重下降趨勢減緩。

除體重外，自由飲用DSS水的各組小鼠也出現飲食減少的癥狀，且第4天開始出現不同程度的腹瀉，第6天開始逐漸出現便血等癥狀。第5天開始，模型組小鼠的DAI評分顯著增加，與空白組具有極顯著差異(P<0.01)。至第8天，模型組的DAI評分達到最高。其中殼寡糖各劑量組和陽性組，相比模型組，DAI評分均有下降趨勢，與模型組無顯著區別(P>0.05)，其中殼寡糖各劑量組評分低于陽性組。

圖1 殼寡糖對結腸炎小鼠體重變化率和DAI評分的影響Fig.1 Effects of COS on the weight change and DAI score of colitis in mice注：模型組與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01。Note:Model group compared with control group,#P<0.05,##P<0.01.

2.2 結腸長度、病理組織學評分

結腸長度是衡量小鼠結腸炎的一個重要指標，隨著炎癥的加重，結腸會腫脹縮短。

如圖2和表2所示，空白組小鼠結腸表面光滑，未見水腫充血癥狀，腸內糞便成型，長度最長，而模型組小鼠的結腸相比空白組長度極顯著縮短(P< 0.01)，且伴有明顯水腫，腸道內糞便呈血水樣膿液。干預后，小鼠結腸長度縮短情況有所緩解，其中殼寡糖低劑量組的結腸縮短程度相比模型組具有極顯著差異(P< 0.01)，說明殼寡糖70 mg/kg劑量下能顯著緩解DSS誘導的結腸縮短癥狀。而陽性組與模型組沒有明顯變化(P> 0.05)。

圖2 殼寡糖對結腸炎小鼠結腸長度的影響 Fig.2 Effects of COS on the colon length of colitis in mice注：箭頭右邊腸道為結腸。a：空白組；b：模型組；c：陽性組；d：殼寡糖低劑量組；e：殼寡糖高劑量組，下同。Note:The right part of the arrow is the colon.a:Control group;b:Model group;c:SASP;d:COSL;e:COSH,the same below.

表2 殼寡糖對結腸炎小鼠結腸長度和重量/長度比值的影響

圖3 小鼠結腸組織HE染色病理圖(×100)及評分圖Fig.3 Histopathological microphotographs and scores of colonic mucosa of mice stained with hematoxylin and eosin (×100)注：與空白組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01，下同。Note:Compared with control,##P<0.01;Compared with model, *P<0.05,**P<0.01,the same below.

經過石蠟包埋H&E染色后，鏡檢觀察，如圖3所示：空白組小鼠的結腸粘膜層完整，腺體排列整齊，未見明顯炎癥細胞浸潤。而模型組的結腸粘膜明顯水腫，腺體明顯缺失，隱窩和杯狀細胞消失大半，炎癥細胞浸潤情況嚴重，病理評分與空白組相比極顯著增加(P<0.01)。而結腸炎小鼠給藥(陽性藥和殼寡糖)后，結腸粘膜的上皮細胞較模型組完整，炎癥細胞浸潤雖至粘膜下層，但程度較輕，顯示損傷有所改善。其中陽性組和殼寡糖高劑量組病理評分與模型組相比，顯著下降(P<0.05)。殼寡糖低劑量組的杯狀細胞隱窩等結構是所有飲用DSS水小鼠中最完整的，與模型組具有極顯著差異(P<0.01)。

2.3 髓過氧化物酶

如圖4所示，飲用DSS水后，模型組小鼠的結腸髓過氧化物酶活性(MPO)較空白組升高，且具有顯著差異(P<0.05)。給藥干預后，陽性組的MPO活性顯著下降，與模型組有顯著差異(P<0.05)，而殼寡糖低、高劑量組的MPO活性相對模型組有一定下降，但沒有顯著差異(P>0.05)。

圖4 殼寡糖對結腸炎小鼠結腸組織MPO活性的影響Fig.4 Effects of COS on the MPO activity of colitis in mice

2.4 結腸炎癥因子

ELISA檢測結果所示圖5，與空白組相比，模型組小鼠中結腸組織的促炎因子IL-6和TNF-α水平升高，且具有極顯著差異(P<0.01)，表明DSS引起明顯結腸炎癥；給藥后，與模型組相比，殼寡糖低、高劑量組的小鼠能顯著下調結腸組織中的促炎因子(P<0.05)，其中陽性組與模型組具有極顯著差異(P<0.01)，水平接近空白組。

圖5 殼寡糖對結腸炎小鼠結腸組織IL-6和TNF-α濃度的影響Fig.5 Effects of COS on the concentrations of IL-6 and TNF-α in colonic homogenates of colitis in mice

3 討論

DSS結腸炎模型是1990年建立的國際公認并被廣泛應用的實驗性UC動物模型，其病理改變為潰瘍形成、隱窩膿腫、小血管炎癥、杯狀細胞減少以及各種炎性細胞的浸潤，和人體結腸炎臨床癥狀及其相似。國家推薦殼寡糖的人體劑量為0.5 g/人，換算成小鼠劑量為70 mg/kg，因此，利用此模型，我們選用70 mg/kg和140 mg/kg兩種殼寡糖劑量探究其對DSS誘導結腸炎的干預效果。韓國一篇文獻對殼寡糖進行了急性毒性實驗，認為殼寡糖在小鼠體內的LD50超過5.0 g/kg[17]。Zhao等[18]對殼寡糖功能食品進行的安全性評價顯示，通過對小鼠(1.25 g/kg/天)、大鼠(1.47 g/kg/天)給藥(約臨床推薦劑量的312～368倍)，10天內未觀察到急性毒性反應。本實驗通過讓小鼠自由飲用3% DSS 7天，建立潰瘍性結腸炎模型。在實驗第6天可觀察到模型組小鼠出現典型的結腸炎生理癥狀，如體重減輕，食欲不振，毛發不光滑、腹瀉、糞便粘稠帶血甚至肛門帶血等。第八天解剖發現模型組小鼠結腸縮短、結腸組織充血、水腫，HE染色發現結腸粘膜水腫，上皮細胞不完整、隱窩腺體結構消失、炎癥浸潤嚴重等。而通過殼寡糖低劑量(70 mg/kg)、高劑量(140 mg/kg)干預的小鼠，上述癥狀均有所改善。和Yousef等[15]的結果一致，他指出的殼寡糖能減少腸道上皮細胞的凋亡，抑制炎癥，保護腸上皮屏障的結構和功能完好。有研究認為炎性腸病是由腸上皮屏障缺陷和粘膜免疫應答失調引起的[2]，殼寡糖能保護腸上皮細胞，說明其在腸炎中起到了重要的保護作用。本實驗中，殼寡糖70 mg/kg劑量組在改善結腸縮短程度、緩解結腸粘膜水腫、保護杯狀細胞和隱窩結構等方面，與模型組相比具有顯著性差異，而140 mg/kg劑量組在改善結腸縮短程度方面，相比模型組沒有顯著性差異，在改善病理組織評分上僅有顯著差異，顯示殼寡糖低劑量組對DSS誘導結腸炎小鼠的保護作用更好。結果表明70 mg/kg劑量殼寡糖有一定緩解小鼠結腸縮短，保護結腸結構的作用，有助于殼寡糖在國家推薦的劑量下進行開發應用。

目前IBD的治療方向主要有氧化應激和炎癥。其中認為氧化應激是IBD的致病基礎，其中過量的氧自由基是潰瘍性炎癥組織損傷和結腸炎形成的關鍵因素[19]。隨著MDA的產生，過量的NO 產生氧自由基，引起氧化損傷，從而導致組織中大量炎性細胞的浸潤[20]。中性粒細胞在UC早期是最快募集到炎癥部位的免疫細胞。其具有雙重作用，一方面在上皮隱窩和腸腔內聚集，通過釋放活性氧(ROS)分泌IL-1、IL-6、MPO等，誘導進一步的組織損傷，另一方面通過分泌抗炎因子積極維持組織環境穩態，并可限制微生物侵襲[21]。Qiao等[22]研究發現殼寡糖在LPS誘導的敗血癥小鼠模型中能降低受損器官中性粒細胞的浸潤和脂質過氧化反應。Dou等[23]在兔體內發現殼寡糖能抑制已活化的中性粒細胞產生活性氧、抑制其脫顆粒和黏附，從而起到抗炎作用。髓過氧化物酶值(MPO)是組織損傷和中性粒細胞(PMN)浸潤的標志，可導致粘膜破裂和潰瘍，且與IBD有重要關系[24,25]。

實驗中結腸炎模型組小鼠MPO活性相比空白組顯著上升，表明中性粒細胞在腸道組織內明顯增多，浸潤嚴重。殼寡糖干預后，結腸組織MPO活性有所下降，雖然未與模型組具有顯著差異，但也有減緩中性粒細胞在腸道聚集，減少進一步組織損傷的趨勢。這和Dou等[11]在糖原性腹膜炎小鼠中發現的殼寡糖能促進中性粒細胞的凋亡，減少MPO的釋放一致，猜測其可能通過活化PLD和PI3K，誘導中性粒細胞產生超氧化物等物質有關。

而UC是多種因素共同作用的結果，其中細胞因子在其中也發揮著重要作用。IL-6在低濃度時可刺激T細胞的增殖，活化B細胞的增殖，分泌抗體，高濃度時參與機體炎癥反應。TNF-α，又稱腫瘤壞死因子-α，由活化后的巨噬細胞Ⅱ單核細胞活化產生，促進凋亡。IL-6和TNF-α作為兩種重要的炎癥細胞因子，是機體受到致病刺激后，反應最快速且顯著的炎癥因子，常見于各種免疫病、炎癥反應、腫瘤免疫等病理過程[26]。在UC患者結腸粘膜組織中，IL-6和TNF-α在活動期的表達遠高于緩解期，在腸道粘膜的炎癥和免疫反應中也起到重要作用,被認為是介導IBD的關鍵細胞因子[27]。核因子-κB(NF-κB)是一種有關炎癥細胞因子表達的重要轉錄因子，機體受到刺激后，IκB可被激活降解，激活胞漿內NF-κB并進入細胞核，誘導基因轉錄，生成各種炎癥因子或趨化因子，如 IL-1β、IL-6、IL-12和TNF-α等，通過反饋放大進一步加劇。Youself等[15]認為殼寡糖通過抑制NF-κB通路緩解機體炎性反應。本實驗中潰瘍性結腸炎小鼠結腸組織中的IL-6和TNF-α表達顯著升高，而殼寡糖低、高劑量組干預后能顯著降低其表達水平，與Yang[14]和Youself等[15]結果一致。表明殼寡糖可通過緩解炎性反應有效改善結腸炎癥狀。

通過殼寡糖兩個劑量的實驗結果比較發現，兩組劑量的殼寡糖均有減緩DSS誘導的體重損失、結腸縮短和抑制疾病活動指數、MPO活性上升的趨勢，能顯著改善病理組織學變化、組織TNF-α、IL-6含量的增加，其中低劑量組較高劑量組在緩解結腸長度、病理組織學變化中具有更優作用。表明低劑量組COS在緩解結腸炎癥上具有更好的效果。Yousef等[15]用1、5、10、20、50、100 mg/kg劑量COS處理結腸炎小鼠，發現10和20 mg/kg COS具有最好效果，在之后的LPS、TNF-α誘導的T84細胞中，也發現了類似的COS劑量-效果之間的鐘形關系，猜測可能與COS能刺激兩種不同的信號通路，產生相反效應，引起功能拮抗有關。此劑量-效果之間的聯系在本實驗室之前的研究中也有發現，Ding[28]將35、70、140、210 mg/kg劑量COS應用于酒精性脂肪肝小鼠，發現70和140 mg/kg組的保護效果較好。本文所選70和140 mg/kg COS可能正好處于鐘形的中后部分，實驗結果顯示低劑量組效果略好于高劑量組。

綜上所述，殼寡糖能有效緩解DSS誘導的結腸炎癥狀，其中70 mg/kg的殼寡糖在緩解結腸長度、結腸病理組織學變化上，相比140 mg/kg更有效，且在人體推薦劑量內，更適合作為應用劑量。同時，殼寡糖可能通過緩解中性粒浸潤程度和抑制促炎因子的釋放，起到降低炎癥、緩解IBD癥狀的作用。然而，殼寡糖在抑制炎性細胞因子釋放中的具體作用機制還有待進一步驗證。