殼聚糖生姜精油涂膜對鮮銀耳活性氧代謝和組織超微結構的影響

羅 楊，李 娟，陳 崗,2，吳 振，詹 永,2，廖 霞，楊 勇,2*

1重慶市中藥研究院；2重慶市中藥大健康工程技術研究中心；3中藥健康學重慶市重點實驗室，重慶 400065

銀耳(Tremellafuciformis)是一種優質的藥食兩用菌。中醫認為銀耳具有滋陰潤肺、養胃生津的功效[1]。銀耳含有多糖、黃酮類酚類、以及多種氨基酸等活性成分，被稱為“菌中之王”[2]。鮮銀耳雖營養豐富，但含水量極高，采后極易腐爛變質，故銀耳一般以干制品形式出售，嚴重降低了銀耳的營養品質及附加值。隨著近年來各種綠色高效的保鮮技術的研究和發展，銀耳有望擺脫傳統干制產品的命運，實現安全鮮銷。其中，包括殼聚糖、香辛料精油等天然保鮮劑因其高效、方便、安全、天然，越來越受到關注[3]。

殼聚糖是近年來備受人們關注的新型安全保鮮劑，在果蔬中應用較多，而在食用菌保鮮中的研究還不多。有研究表明，殼聚糖可明顯降低雙孢菇的失水率、硬度、腐爛度、開傘率和褐變度，提高子實體可溶性蛋白、總糖、還原糖的含量，SOD和CAT的活性也得到誘導提高，并可維持細胞膜的完整性，避免PPO與酚類物質接觸，從而抑制雙孢菇的褐變發生[4]。此外，本文作者在之前的研究中也發現，殼聚糖在常溫貯藏條件下能夠顯著降低鮮銀耳的發病率和病情指數、誘導提高鮮銀耳抗病及活性氧代謝能力[5]。殼聚糖能夠延緩果蔬成熟并保持其品質，其作用機理主要是利用其成膜性和抗菌性[6]。但是，單純的殼聚糖涂膜因其抗菌性能不甚理想，殼聚糖基復合涂膜被認為是加強保鮮效能的良好手段[7]。生姜精油等香辛料精油中含有抗氧化性強的鄰羥甲基苯甲酸內酯、酚類及其衍生物、黃酮類、聚乙炔、香豆素等活性成分，能夠有效延緩食品中過氧化物的形成[8]，同時還對絕大多數的細菌、真菌、霉菌有較強的抑制效果[9]。目前，生姜精油已被廣泛應用到禽肉保鮮領域[10]。故本文利用成膜性良好的殼聚糖與抗菌性較好的生姜精油進行復配，以此進一步提升保鮮能效。同時，目前我國生鮮冷鏈物流產業得到大幅度發展，鮮銀耳已有望實現全冷鏈鮮銷，因此有必要在前期研究基礎上進一步探討冷藏條件下復配保鮮劑對鮮銀耳活性氧代謝的影響，并結合鮮銀耳組織微觀形貌特征對殼聚糖-生姜精油涂膜保鮮機理進行討論，為進一步提升鮮銀耳冷藏保鮮能效提供理論和實踐基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試銀耳：由雙福國際農貿城鮮銀耳批發商提供。選取朵形飽滿、表面干凈、無病蟲害、大小相對一致、無機械損傷的新鮮銀耳。

1.2 主要試劑

生姜精油：經超臨界CO2萃取獲得，由重慶華萃生物科技股份有限公司提供；殼聚糖：食品級，脫乙酰度50%～60%，黏度200 mps，山東濰坊海之源生物科技有限公司提供。其他化學試劑：均為分析純。

1.3 殼聚糖-生姜精油保鮮劑制備方法

將10 g殼聚糖溶于1L 0.5%(V/V)乙酸水溶液中，放于恒溫水浴鍋中，70 ℃恒溫水浴20 min，攪拌使其完全溶解，冷卻后，加入10 g的生姜精油及3 g單甘酯，補足余量的水，磁力攪拌20 min，將乳液高壓均質3次，均質壓力35 MPa，均質后即得殼聚糖-生姜精油保鮮劑。

1.4 保鮮處理

選取質量為130～150 g/朵的鮮銀耳，清除菌體表面的雜質，噴灑殼聚糖-生姜精油保鮮液20次(每次劑量1 mL)。對照處理組以蒸餾水噴灑20次(每次劑量1 mL)。待銀耳表面液體自然吸收瀝干后，將其放入帶蓋的PE材質塑料保鮮盒中(每個盒子裝1朵銀耳)，置于4 ℃，相對濕度90%的環境中貯藏，定期觀察及取樣測定。

1.5 測定指標及方法

貯藏后第0、10、20、30、40天隨機取樣測定各種指標。

1.5.1 發病率的測定

每隔一段時間觀察統計銀耳發病率，殼聚糖-生姜精油涂膜處理組與對照組各20朵銀耳，重復三次。

1.5.2 病情指數測定

病情指數=100×∑(各級銀耳朵數×各級代表值)/(銀耳總朵數×最高級代表值)

0級：全朵無病；1級：全朵25%以下的耳片有少數病斑；2級：全朵50%以下的耳片有少量病斑或25%以下的耳片有較多的病斑數；3級：全朵75%以下的耳片發病或全朵25%以下的耳片完全霉變腐爛；4級：全朵75%以上的耳片發病或全朵50%以下的耳片完全霉變腐爛～整朵霉變腐爛。

1.5.3 失重率的測定

采用稱重法，每隔12 h測定一次銀耳失重率，殼聚糖-生姜精油涂膜處理組與對照組各10朵銀耳。重復三次。計算方法如下：

1.5.4 過氧化物酶(POD)和多酚氧化酶(PPO)的提取及活力測定

參照Zauberman[11]的方法測定。

參照Wang[12]的方法測定。

1.5.6 過氧化氫(H2O2)含量測定

參照Patterson[13]的方法測定。

1.5.7 過氧化氫酶(CAT)提取及活力測定

取1.0 g鮮銀耳，加入3.0 mL經4 ℃預冷的50 mmol/L磷酸緩沖液(pH7.5)(含5 mmol/L二硫代蘇糖醇和2%聚乙烯吡咯烷酮)，在冰浴條件下研磨勻漿，于4 ℃、12 000 rpm離心30 min，收集上清液，用于CAT活性測定。

CAT活性參考Beers和Sizer[14]的方法測定。

1.5.8 超氧化物歧化酶(SOD)的提取及活力測定

SOD活性參考Luo[5]的方法測定。

1.5.9 涂膜銀耳的微觀結構表征觀察

采用掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope，SEM)對殼聚糖-生姜精油保鮮液處理后的鮮銀耳分別在低溫(4 ℃)貯藏0天和30天進行微觀形貌觀察，并設立空白對照銀耳。

具體方法是，取鮮銀耳1 cm2左右，用雙面膠粘于測試臺，直接于離子濺射儀上噴鍍金屬鉑，在SEM下觀察其微觀形貌。電鏡測試條件為JEM-2000FX分析型掃描電子顯微鏡，加速電壓為3.0 kV，不同倍數下比較觀察保鮮液處理鮮銀耳與對照樣品表面微觀形貌。

1.5.10 數據統計及圖形分析

用Excel 2010統計分析所有數據，計算標準誤、制圖；并對數據進行方差分析，利用鄧肯式多重比較對差異顯著性進行分析，P<0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳自然發病率、病情指數的影響

圖1 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳自然發病率、病情指數的影響Fig.1 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on disease incidence anddisease index of freshtremella注：圖中豎線代表標準誤，下同；不同字母表示相同貯藏天數時與對照組差異顯著。Note:Bars indicate the standard errors,the same below;Different letters indicated significant difference between the treatment group and the control group at the same storage days.

鮮銀耳的殼聚糖-生姜精油涂膜處理組自然發病率和病情指數顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。處理組鮮銀耳在4 ℃貯藏10天時發病率為0，而對照組發病率為5.0%；貯藏20天時處理組發病率為4.15%，對照組發病率為14.53%，對照組發病率約是處理組的3.5倍；貯藏40天后處理組發病率為17.6%，對照組發病率為36.7%，對照組比處理組高2.1倍。新鮮銀耳在20 ℃貯藏10天時處理組病情指數為0，對照組為3.3；貯藏20天時處理組病情指數為2.13，對照組為8.56，對照組病情指數約是處理組的4倍；貯藏30天時處理組病情指數為3.86，對照組為13.75，對照組比處理組高3.56倍。整個貯藏期間，殼聚糖-生姜精油涂膜處理都顯著降低了新鮮銀耳的發病率和腐爛程度。

2.2 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳失重率的影響

殼聚糖有良好的成膜性，能在鮮銀耳表面形成一層類似氣調包裝的薄膜，抑制呼吸作用，阻止水分的蒸騰和散失[17]，從而降低鮮銀耳在貯藏期間尤其是貯藏后期的失重率(圖2)。貯藏30天時，殼聚糖-生姜精油涂膜處理鮮銀耳失重率為3.15%，對照組失重率為6.75%，失重率降低53.3%，二者差異顯著(P<0.05)。整個貯藏期間，殼聚糖-生姜精油涂膜處理都明顯降低了鮮銀耳失重率，保持了銀耳質量。

圖2 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳失重率的影響Fig.2 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on weight loss rate of fresh tremella 注：*相同貯藏天數時與對照組差異顯著，下同。Note:*There is significant difference between the treatment group and the control group at the same storage days,the same below.

2.3 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳POD、PPO活性的影響

過氧化物酶(POD)是植物細胞中主要的氧化酶，在許多果蔬上表現為一種衰老酶，其活性提高是果蔬成熟衰老的體現[18]。本研究結果表明，鮮銀耳的POD活性在貯藏期間呈先上升后下降趨勢(圖3)，相比對照組在貯藏10天時POD活性急劇上升，殼聚糖-生姜精油涂膜處理顯著抑制了鮮銀耳的POD活性，活性比對照低37.8%，差異顯著(P<0.05)。在整個貯藏期內，處理組POD活性都低于對照組，這表明殼聚糖-生姜精油涂膜有抑制鮮銀耳POD活性上升的作用。

多酚氧化酶(PPO)是引起植物組織褐變的重要酶之一，且與果蔬的抗病性有關[19]。鮮銀耳PPO活性在貯藏期間呈下降趨勢(圖3)。但殼聚糖-生姜精油涂膜處理可延緩鮮銀耳PPO活性下降，在貯藏期間均高于對照，且在第10天和30天時促進PPO活性上升。這表明殼聚糖-生姜精油涂膜處理提高了鮮銀耳PPO活性，從而延緩褐變、衰老，延長鮮銀耳的貯藏保鮮期。

圖3 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳POD、PPO活性的影響Fig.3 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on POD and PPOactivity of fresh tremella

2.4 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳和H2O2含量的影響

圖4 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳及H2O2含量的影響Fig.4 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on H2O2 contentof fresh tremella

2.5 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳CAT、SOD活性的影響

圖5 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳CAT、SOD活性的影響Fig.5 Effect of chitosan ginger oil coating treatment on CAT and SOD activity of fresh tremella

過氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)在清除自由基、延緩衰老等方面有著重要的作用[22]。鮮銀耳CAT活性在貯藏期間呈先下降后逐漸上升趨勢(圖5)，而殼聚糖-生姜精油涂膜處理可顯著提高鮮銀耳貯藏前期的CAT活性，第10天和第20天時其活性分別為對照組的2.4和2.5倍，差異顯著(P<0.05)。

2.6 殼聚糖-生姜精油涂膜處理對鮮銀耳微觀形貌特征的影響

從圖6和圖7的SEM掃描結果可看出，在貯藏初期(0天)，對比A和B樣品，保鮮液吸附在菌絲體上，并填充到子實體中，使得保鮮處理的鮮銀耳的組織空隙被填滿，菌絲細胞比對照變得更粗壯、飽滿，而未經保鮮液處理的鮮銀耳子實體表面則有很多充滿水的空隙。低溫貯藏30天后，涂膜保鮮液處理銀耳(樣品C)外觀保持良好，微觀形貌較貯藏初期(樣品A)有略微變化，菌絲體間開始出現少量空隙，但此時對照銀耳(樣品D)外觀已出現脫水變黃、萎焉，微觀形貌則表現為脫水后菌絲細胞扁平的擠壓在一起。從圖8的銀耳色澤來看，C和A相比幾乎無變化；但D相比B明顯出現了黃色，且整朵銀耳開始脫水、萎焉。

圖6 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳表面微觀形貌(×500)Fig.6 The surface microstructure of freshtremella with chitosan ginger oil coating(×500)注：A為殼聚糖-生姜精油涂膜處理銀耳貯藏0天；B為對照銀耳貯藏0天；C為殼聚糖-生姜精油涂膜處理銀耳4 ℃貯藏30天；D為對照銀耳4 ℃貯藏30天，下同。Note:A:Fresh tremella a with chitosan ginger oil coating for 0 days;B:Control tremella for 0 days;C:Fresh tremellawith chitosan ginger oil coating stored at 4 ℃ for 30 days;D:Control tremella at 4 ℃ for 30 days,the same below.

圖7 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳表面微觀形貌(×2 000)Fig.7 The surface microstructure of fresh tremellawith chitosan ginger oil coating(×2 000)

圖8 殼聚糖-生姜精油涂膜鮮銀耳照片Fig.8 Photo of fresh tremellawith chitosan ginger oil coating

上述試驗結果表明，殼聚糖-生姜精油成膜液形成致密的網狀結構，附著在銀耳表面，填充了銀耳菌絲細胞空隙，其作用類似于氣調包裝，隔絕外界微生物的侵染，防止鮮銀耳水分及營養成分流失，很好地保持了鮮銀耳的品質。

3 討論

由于生姜精油具有辛辣味、易揮發、易氧化等缺點，限制了其作為保鮮劑等食品添加劑在食品工業中的應用。而生姜精油通過與殼聚糖復配，形成了具有良好穩定性的保鮮劑[24]，能很好地解決精油中有效抑菌成分不穩定、易揮發、影響保鮮產品品質等問題，且較單獨使用殼聚糖涂膜[5]保鮮效果更好。精油與成膜劑混合均勻，形成精油液滴與多糖結合的“疏水-親水”半透膜，既保留了糖類物質的膜功能特性，且均勻分散的精油所形成的疏水性又使親水性物質與鮮銀耳表面和空氣相隔絕，從而達到延長鮮銀耳貨架期的目的；半透膜能夠覆蓋在銀耳表面的微孔上，并部分滲入到銀耳組織中，減小表皮組織的孔隙，從而抑制食用菌的呼吸及蒸騰作用；成膜液是基于多糖分子因相互作用形成致密的網狀結構(圖6、圖7)，類似于氣調包裝，從而對鮮銀耳起到隔絕環境的作用，避免受外界微生物侵染，減少機械損傷及腐爛，降低鮮銀耳失重率(圖2)。

POD一般被認為是果實成熟和衰老的標志性指標。PPO與果蔬抗病性和褐變發生密切相關，它們可催化木質素及其它酚類物質的氧化，并提高機體抗病能力。本研究結果表明，殼聚糖-生姜精油提高鮮銀耳PPO活性(圖3)，對鮮銀耳POD活性的上升則有抑制作用(圖3)，說明殼聚糖-生姜精油涂膜可誘導鮮銀耳抗病性增強，顯著降低腐爛發病率及發病程度(圖1)，延緩褐變、衰老，延長鮮銀耳的貯藏保鮮期(圖8)。

綜上所述，殼聚糖-生姜精油一方面通過良好的成膜性，形成致密的類似氣調包裝網狀結構，避免外界微生物侵染，減少機械損傷，防止鮮銀耳水分及營養成分流失；另一方面也能通過影響活性氧代謝，激發銀耳體內包括SOD途徑、CAT途徑等一系列清除活性氧、增強抗病性的反應，但因銀耳機體處于低溫狀態下，活性氧H2O2的產生和清除趨于平衡的狀態，說明低溫可延緩鮮銀耳的活性氧代謝高峰的到來，有效抑制膜質過氧化作用的發生，這對保持鮮銀耳組織的完整性和品質具有重要的意義。

目前，全國的冷鏈物流產業得到空前的發展和壯大，在此基礎上，通過天然保鮮劑復配涂膜等技術手段增強冷鏈保鮮能效，可提升銀耳產品附加值和產業發展空間，更能拉動冷鏈物流產業的發展和進步。因此筆者認為，利用殼聚糖、生姜精油等天然成分復配涂膜結合冷鏈物流等新興高效安全的保鮮技術應對銀耳采后貯藏難的問題，較常溫貯運狀態下使用單一保鮮劑保鮮能效提升不少，若能將其成功商業化應用于銀耳乃至其他食用菌采后保鮮領域，是提高銀耳貯藏安全性和商品附加值，滿足當前消費者對鮮食農產品天然、綠色、安全、健康的需求的有效途徑。