脂多糖刺激對馬氏珠母貝血細胞DNA甲基化修飾的影響

焦 鈺，梁金嬋，谷澤豐，張鵬飛，李榕嬌，羅少杰

脂多糖刺激對馬氏珠母貝血細胞DNA甲基化修飾的影響

焦 鈺1,2，梁金嬋1，谷澤豐1，張鵬飛1，李榕嬌1，羅少杰1

（1. 廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；2. 廣東省珍珠養殖與加工工程技術研究中心，廣東 湛江 524025）

【】研究馬氏珠母貝（）血細胞基因組DNA的甲基化修飾情況及其在脂多糖（LPS）刺激后的變化，為探究甲基化修飾在珍珠貝免疫防御中的作用提供理論基礎。運用甲基化敏感擴增多態性法（MSAP）分析馬氏珠母貝血細胞（正常養殖貝）以及注射LPS后（6、12、24 h）基因組CCGG 位點甲基化的修飾水平變化，并對甲基化修飾位點進行回收測序。共獲得1 102個清晰可辨的DNA條帶，其中全甲基化位點條帶215個，半甲基化位點條帶127個，非甲基化位點條帶760個。對照組血細胞基因組CCGG位點的甲基化修飾比例為23.76%，注射LPS后，甲基化比例為28.10% ~ 48.25%，注射6 h時最低，12 h時最高；對特異性片段測序后，經Blast比對，得到5條存在甲基化修飾的基因序列，其中2條具有注釋信息，分別是干擾素調控因子（Interferon regulatory factor）和磷脂酶BL2（Putative phospholipase B-like 2）。馬氏珠母貝血細胞基因組CCGG位點的甲基化修飾參與調控LPS誘導的免疫反應，在免疫防御中發揮重要作用。

馬氏珠母貝；DNA甲基化；免疫防御；甲基化敏感擴增多態性法（MSAP）

插核育珠手術是人工培育珍珠最核心環節。在插核初期，插核手術會引起珍珠貝的免疫反應，過強的免疫反應會導致珍珠囊發育異常，珍珠貝的吐核，甚至是死亡，嚴重影響珍珠的產量和質量[1]。馬氏珠母貝（）是珍珠培育的主要育珠貝，研究其免疫機制對珍珠培育產業有重要意義。目前，已獲得數十種馬氏珠母貝免疫相關基因，如異體移植炎癥因子1（allograft inflammatory factor-1）[2]、谷胱甘肽 S-轉移酶（glutathione S-transferase 3）[3]和F型凝集素（F-type lectin）[4]等。本課題組通過分析馬氏珠母貝基因組和轉錄組數據也獲得多個免疫相關基因，如紫色酸性磷酸酶（purple acid phosphatase）[5]、腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor-associated factor 6）[6]、核因子-κB激酶抑制因子ε（inhibitor of NF-κB kinasesε）[7]和Toll樣受體2（toll like receptor 2）[8]等。但馬氏珠母貝免疫反應是一個復雜的、受精細調控的過程，每個相關功能基因的表達均受嚴格的調控[9]。目前在功能基因表達調控方面研究較少[10]。

DNA甲基化是DNA化學修飾的一種形式，可在不改變DNA序列的情況下，通過調節基因表達在細胞分化、胚胎發育、環境適應和疾病發生發展上發揮重要作用[11]。研究發現，哺乳動物基因組多呈現大面積連續的甲基化狀態，人的基因組中發生甲基化的胞嘧啶高達4% ~ 6%[12]，甲基化位點主要集中在基因5′ 端的非編碼區，并成簇存在，在某些區域，形成鳥嘌呤和胞嘧啶的富集區，即CpG島。無脊椎動物基因組的甲基化比例較少，且不同種類甲基化模式不同，如模式生物果蠅（）基因組中發生甲基化的胞嘧啶不到1%[13]，家蠶（）基因組內僅有0.11%，且基因組中的甲基化位點主要分布在基因的編碼區域[14]。長牡蠣（）基因組中約2%的胞嘧啶呈現甲基化修飾，甲基化修飾位點也多分布于基因的編碼區內，與基因表達多數呈正相關，并參與調控牡蠣的生長發育和環境適應[15-17]。關于DNA甲基化修飾是否參與珍珠貝的免疫防御反應還未見報道。

甲基化敏感擴增片段多態性技術（Methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP）是一種依托于擴增片段長度多態性（Amplified fragment length polymorphism, AFLP）技術發展的基因組胞嘧啶甲基化檢測技術，是基于選擇性PCR技術的限制性內切酶法，由Reyna-López等[18]在1997年首次報道并使用。MSAP用兩種對基因組DNA胞嘧啶甲基化敏感度不同的同裂酶I和II分別替代AFLP中的高頻酶I，并分別與R I一起對基因組DNA進行酶切，從而達到檢測DNA相同的四核苷酸序列CCGG甲基化的目的[19-21]。目前，MSAP技術被廣泛用于水產經濟動物基因組DNA甲基化檢測，如櫛孔扇貝 ()[22]、太平洋牡蠣 ()[23]{姜群, 2015 #1}、斑馬魚()[24]、鞍帶石斑魚 ()[25]等。

脂多糖（Lipopolysaccharides，LPS）是一種脂質和多糖的復合物，為革蘭陰性細菌細胞壁的主要成分，可誘導有機體的免疫反應。本研究擬利用MSAP評估馬氏珠母貝血細胞基因組甲基化修飾情況及其在LPS刺激后的變化，為闡述基因組甲基化修飾在珍珠貝免疫反應中的作用和機制提供基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 5000bp/2000bp/20bp DNA Marker、PrimerSTAR RMax DNA Polymerase、pMDT M18T Vector Cloning Kit，寶生物工程（大連）有限公司；dNTP Mixture（10 mmol/L）、Genomic DNA Kit、SanPrep 柱式質粒小量抽提試劑盒、6×Loading buffer，生工生物工程(上海)有限公司

1.1.2 實驗用貝 實驗用馬氏珠母貝130只，殼長(62.41±3.09)mm，取自廣東省湛江市徐聞縣大井村海域。隨機取10只為正常對照組，其余120只貝隨機分成兩組，每組60只，分別在閉殼肌注射100 μL 10 μg/mL LPS溶液或者100 μL的磷酸鹽緩沖液（PBS）。LPS配制方法參考文獻[6]。在注射后6、12、24 h從PBS、LPS組分別隨機選取貝10只，抽取血液，混合，以3 500 r/min離心5 min，得血細胞。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取和MSAP分析 參照基因組DNA提取試劑盒說明書，分別提取對照組、PBS和LPS注射后6、12、24 h血細胞DNA。MSAP分析分4個部分進行，分別是雙酶切反應、T4連接反應、擴增反應、產物檢測與分析。

LPS和PBS處理后不同時間段的DNA樣品分別進行雙酶切反應，設置R II、R III 兩組酶，得到不同的酶切片段。25 μL酶切體系： DNA 0.5 μg，CutSmart（酶的緩沖液）2.5 μL，III 1 μL，R I 1 μL，37 ℃下反應2 h。20 μL連接體系：酶切產物5 μL，R I接頭（10 pmol/μL）1 μL，MH接頭（50 pmol/μL）1 μL，T4 DNA Ligase 0.8 μL，Buffer 4 μL，ddH2O 8.2 μL，16 ℃連接12 h。

擴增體系分為預擴增體系和選擇性擴增體系。10 μL預擴增體系：模板DNA 0.6 μL，Pre-R I0.4 μL，pre-MH 0.4 μL，rTaq 5 μL。10 μL選擇性擴增體系：模板DNA 0.4 μL，R I（為引物1–5，表1）0.4 μL，MH-（為引物1–3，表1）0.4 μL， rTaq 5 μL。引物序列均是引用文獻[26]。

選擇性擴增產物與20 bp DNA Ladder（Dye Plus）上樣緩沖液以體積比2∶1比例混合，在室溫下混合后，再用聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。根據圖譜分析甲基化狀態，如果M和H泳道均有帶，則為非甲基化位點，標記為a；如果H無帶，M有帶，則為全甲基化位點，標記為b；如果H有帶，M無帶，則為半甲基化位點，標記為c。

組織總條帶數= 非甲基化條帶數 + 全甲基化條帶數 + 半甲基化條帶數；

非甲基化位點比例 (%) = 非甲基化條帶數/總條帶數；

全甲基化位點比例(%) = 全甲基化條帶數/總條帶數；

甲基化修飾比例 (%) = (全甲基化條帶數 + 半甲基化條帶數) / 組織總條帶數。

表1 MSAP分析的接頭和引物序列

1.2.2 甲基化修飾片段的回收及測序 對目的片段切膠，搗碎分裝并記錄產物情況。分別加入20 μL雙蒸水，置37℃下12 h，用相應的引物組合及擴增條件進行PCR擴增，切膠回收并純化，回收產物與pMD18-T載體連接，經轉化，挑取陽性克隆，送上海生工生物工程技術服務有限公司測序。測序結果分別通過Blast、NCBI數據庫、本課題組已獲得的馬氏珠母貝基因組數據庫[27]進行同源性檢索和分析。

2 結果

2.1 基因組的提取

所提取DNA檢測結果如圖1，經核酸定量儀檢測，260 nm/280 nm均為1.8 ~ 1.9，說明DNA質量較高，符合MSAP分析要求。

圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 MSAP分析

MSAP雙酶切反應、T4連接反應、預擴增反應、選擇性擴增反應后，選擇性擴增產物經非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染、成像，獲得譜帶清晰、甲基化多態性好、重復性高的擴增圖譜（圖2）。

共獲得1 102個清晰可辨的DNA條帶（表2），其中全甲基化位點條帶215個，半甲基化位點條帶127個，非甲基化位點條帶760個。對照組總擴增條帶181個，LPS組為479個，PBS組為442個。對照組甲基化比例為23.76%。LPS刺激后，甲基化修飾比例為28.10% ~ 48.25%，6 h時最低，12 h時最高。PBS組甲基化比例為22.98% ~ 30.06%，6 h時最低，24 h時最高（圖3）。

M，Msp I和EcoR I雙酶切；H，Hpa II和EcoR I雙酶切；a，非甲基化位點；b，全甲基化位點；c，半甲基化位點

表2 甲基化條帶數目

圖3 LPS刺激對珍珠貝甲基化修飾比例的影響

2.3 基因組CCGG 位點甲基化修飾片段序列分析

將部分甲基化修飾片段進行回收、克隆和測序，得到5條甲基化修飾DNA序列，經Blast（與基因組數據）比對（表3），發現共有3條片段有同源序列，其中2條具有注釋信息，分別注釋為干擾素調控因子（Interferon regulatory factor，IRF）和磷脂酶BL2（Putative phospholipase B-like 2，PLB），其他2條推測可能因位于非編碼區而未找到同源序列。

表3 回收片段注釋信息

3 討論

DNA甲基化是表觀遺傳學研究最深入領域之一，可通過調節基因轉錄在細胞分化、胚胎發育、環境適應和疾病發生發展上發揮重要調控作用[11]。目前，檢測基因組中胞嘧啶甲基化的方法主要有兩大類，一類是檢測基因組中全部胞嘧啶的甲基化程度，通常進行全基因組測序；一類只檢測特定DNA序列的甲基化程度（如MSAP法）[28]。本研究使用具有技術簡單、效率較高的MSAP技術檢測LPS刺激后的馬氏珠母貝血細胞基因組CCGG位點的甲基化修飾變化。

本研究表明，馬氏珠母貝血細胞正常對照組基因組CCGG位點的甲基化修飾比例為23.76%，說明珍珠貝基因組大部分CCGG位點（76.64%）無甲基化修飾，即甲基化修飾有位點選擇性，但具體機制仍需深入研究。已有研究表明，馬氏珠母貝外套膜基因組CCGG位點的甲基化修飾比例為14.46% ~ 19.04%[26]，閉殼肌的甲基化修飾比例為8.04% ~ 9.93%[29]，均低于血細胞甲基化修飾比例。貝類的免疫防御系統主要包括細胞（主要為血細胞）和體液。貝類血細胞可在體內和體外吞噬各種有機或無機顆粒，清除病原微生物、自身損傷或死亡的細胞，而且血細胞可產生各種非特異性體液因子參與貝類免疫防御過程。所以，貝類血細胞在貝類免疫防御機制中起重要作用[30]。馬氏珠母貝血細胞基因組甲基化水平較外套膜和閉殼肌高，說明甲基化修飾在其免疫防御的調控中起重要作用。脂多糖是革蘭陰性細菌細胞壁成分之一，可誘導機體的免疫反應，所以在注射LPS后12 h，甲基化修飾比例最高，說明馬氏珠母貝可通過改變DNA的甲基化修飾調控基因的表達，參與調控機體的免疫防御反應。

通過回收甲基化修飾片段，發現干擾素調節因子（IRF）和磷脂酶BL2（PLB）的編碼區具有甲基化修飾位點。干擾素調節因子是干擾素系統的重要組成部分。干擾素系統作為一種非特異免疫，在脊椎動物的機體防御反應中發揮重要作用。目前，隨著無脊椎動物基因組數據的增加，干擾素系統的關鍵分子（如IRF、類干擾素蛋白、干擾素受體等）相繼被鑒定，多數學者認為無脊椎動物可能存在類似干擾素信號通路，并且在機體的抗病毒反應中發揮重要作用[31]。磷脂酶（PL）是生物體內的可水解甘油磷脂的一類酶，根據其作用位點不同，可分為A（A1、A2）、B、C、D四種。磷脂酶BL2是一種非常重要的代謝酶類，具有水解酶、溶血磷脂酶和轉酰基酶活性[32]。本研究表明，干擾素調節因子和磷脂酶BL2的表達可能被甲基化修飾調控，但具體的調控機制尚需進一步研究。

目前，關于DNA甲基化研究還在不斷地深入與拓展，對于馬氏珠母貝免疫反應研究而言，需進一步將DNA甲基化模式、水平變化、基因修飾和表達量變化與其他表觀遺傳調控機制進行關聯分析，以更好地探究馬氏珠母貝的免疫防御機制。

4 結論

通過MSAP分析，馬氏珠母貝血細胞基因組CCGG 位點甲基化修飾比例為23.76%，注射LPS后的甲基化比例為28.10% ~ 48.25%，6 h時最低，12 h時最高。對特異性片段進行回收、測序后，經Blast比對，得到5條存在甲基化修飾的基因序列，其中2條具有注釋信息，分別是干擾素調節因子和磷脂酶BL2，研究結果表明甲基化修飾參與調控馬氏珠母貝的免疫反應。

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Effect of Genomic DNA Methylation after Lipopolysaccharide Stimulation on the Homcytes from

JIAO Yu1,2, LIANG Jin-chan1, GU Ze-feng1, ZHANG Peng-fei1, LI Rong-jiao1, LUO Shao-jie1

（1.,,524088,; 2.,524025,）

To analyze the DNA methylation level of the hemocytes from pearl oysterafter Lipopolysaccharide (LPS) stimulation, and explore the rules of DNA methylation in the immune defense in.Methylation-sensitive amplification polymorphism (MSAP) technology was used to analyze the methylation levels of the hemocytes fromat 6 h, 12 h and 24 h after LPS injection.A total of 1 102 clear and repetitive DNA bands, including 215 full-methylated sites, 127 hemi-methylated sites and 760 non-methylated sites were obtained. In the LPS group, the percentage of methylated sites was between 28.1% – 48.3%, and the lowest level was at 6 h, the highest level was at 12 h. After recovering and sequencing the specific bands, 5 DNA fragment were confirmed to have been methylated. Among them, two sequences can be annotated. The sequence were holologous to the interferon regulatory factor and a putative phospholipase B-like 2.DNA methylation involved in the immune response stimulated by LPS, and it may play crucial roles in the immune defense of.

; DNA Methylation; immune response; Methylation-sensitive Amplification Polymorphism (MSAP)

Q78；Q959.215+.4

A

1673-9159（2020）03-0007-07

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.002

2019-11-15

國家自然科學基金（31672626）；大學生創新創業訓練項目（CXXL2015041）

焦鈺（1981―），女，博士，副教授，研究方向為海洋生物學。E-mail：jiaoyu1981@hotmail.com

焦鈺，梁金嬋，谷澤豐，等. 脂多糖刺激對馬氏珠母貝血細胞DNA甲基化修飾的影響[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：7-13.

（責任編輯：劉慶穎）