波吉卵囊藻蛋白質提取方法比較及提取條件優化

洪 廷，任佳佳，張 寧，李長玲，黃翔鵠

波吉卵囊藻蛋白質提取方法比較及提取條件優化

洪 廷，任佳佳，張 寧，李長玲，黃翔鵠

（廣東海洋大學水產學院，廣東 湛江 524088；廣東海洋大學深圳研究院，廣東 深圳 518000；廣東省藻類養殖及應用工程技術研究中心，廣東 湛江 524025）

【】探究基于考馬斯亮藍染色法的波吉卵囊藻 () 蛋白質提取方法，以快速測定波吉卵囊藻的蛋白質含量。以凱氏定氮法為基準，以考馬斯亮藍法測定經反復凍融法、超聲波破碎法和堿提法提取的波吉卵囊藻（鮮品）蛋白含量，比較各提取方法的提取效果；通過單因素和響應面實驗，考察堿提法中提取溫度、NaOH濃度和提取時間對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響。堿提法顯著優于其他提取方法（< 0.01）；堿提法中，各因素對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響顯著性由大到小依次為提取溫度、NaOH濃度、提取時間；最佳提取條件：提取溫度74.5 ℃、NaOH濃度0.35 mol/L、提取時間69 min，此時蛋白得率為1.726%，與模型預測值1.731%接近，以凱氏定氮法測定的藻體蛋白質含量為基準，蛋白提取率高達99.20%。堿提法是波吉卵囊藻（鮮品）蛋白的最佳提取方法，采用響應面法建立的模型可較好地預測提取溫度、NaOH濃度和提取時間對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響。

波吉卵囊藻；蛋白提取；快速提取；考馬斯亮藍法；響應面法

波吉卵囊藻（）是亞熱帶對蝦高位養殖池中常見的優勢種群[1]，其植物體呈單細胞或以2、4或8個細胞組成的群體生活，群體外有一層明顯膠質包被[2]。研究發現波吉卵囊藻不僅可吸收和吸附對蝦養殖池塘中的氨氮、亞硝態氮以及重金屬離子污染物[3-4]，還可有效抑制弧菌和藍藻[5]，維持養殖水體中藻相和菌相的平衡，同時在促進對蝦生長和性腺發育，增強對蝦抗病力方面發揮作用[6-7]。目前，波吉卵囊藻已實現常溫活體保存和自然沉降濃縮[8]，波吉卵囊藻微生態制劑在對蝦養殖池塘水質調控方面取得一定成效，然而未見對其生理生化方面尤其是對波吉卵囊藻蛋白質含量、組成及功能方面的研究。

蛋白質是具有極性、疏水性和帶電區域的復雜大分子，有催化和運輸功能[9]，是動植物組織的重要結構成分，尤其是微藻蛋白，在動物飼料或人類功能食品（蛋白質來源）的應用潛力巨大[10]。評估微藻蛋白質水平可為藻類應用及生理生化特性研究提供重要信息。為評估波吉卵囊藻的蛋白質水平，研究波吉卵囊藻的生理生化特性，需要一種針對波吉卵囊藻的快速且相對簡單的蛋白提取方法。

由于微藻細胞較小或細胞壁有彈性，可能會因為無法研磨而出現蛋白質提取困難問題[11-12]。同時不同藻類細胞壁結構有差異，細胞壁結構復雜性可能造成蛋白含量測定結果不同[13-14]，因此，藻類蛋白質提取需針對藻類具體物種進行優化。目前，植物蛋白質提取方法通常有超聲波破碎法、珠磨法、高速剪切法和高壓均質法等[15-16]機械法，以及酶溶法、化學滲透法和反復凍融法[17]等非機械法。Meijer等[17]比較了反復凍融法、堿提取法、超聲波破碎法和珠磨法提取5種微藻蛋白的效果，發現在有輔助提取劑的條件下，超聲波破碎是提取小球藻（）和衣藻（）蛋白的最佳方法，但對杜氏藻（）、紅藻（）和聚球藻（）并不可行。在已報道化學滲透法中，使用熱的堿溶液（95℃ 2 mol/L NaOH）[18]或熱的酸性溶液（三氯乙酸）[19]進行萃取，無需勻漿即可實現藻細胞裂解。Lee等[20]在小球藻和衣藻中加入1 mol/L NaOH，沸水浴5 min，可用于提取蛋白質。

目前，定量蛋白質最常用的方法有福林酚試劑（Lowry法）[21]、考馬斯亮藍法（Bradford法）[22]和凱氏定氮法[16]，其中，凱氏定氮法測定結果準確性和重現性好，是國家標準檢驗飼料中粗蛋白含量的方法，缺點是需要消耗大量實驗材料。本研究以凱氏定氮法為基準，以快速、靈敏的考馬斯亮藍法[23]測定反復凍融法、超聲波破碎法以及堿提法提取的波吉卵囊藻蛋白質含量，以蛋白質得率為指標，通過單因素和響應面實驗優化堿提法中提取溫度、氫氧化鈉濃度和提取時間等參數，以期開發一種適用于波吉卵囊藻鮮品的快速、小規模且相對簡單的蛋白質提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗用波吉卵囊藻由廣東海洋大學水產學院藻類資源開發與養殖環境生態修復實驗室提供。藻種接種于改良f/2培養基[24]中，置于光照培養架，設置溫度（25 ± 2）℃，照度1 500 lx，24 h光照，充氣培養。培養至對數后期時，搖勻，分別取2、4、6、8和10 mL共5個濃度的藻液，以5 000 r/min離心10 min，棄上清液。藻細胞以等體積0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（PBS，北京索萊寶科技有限公司，pH 7.2）洗滌、離心2次后，所得藻泥用于蛋白質提取。

1.2 方法

1.2.1 提取方法對波吉卵囊藻蛋白的提取效果

1.2.1.1 波吉卵囊藻蛋白質提取方法 1）反復凍融法：用2 mL PBS重懸不同濃度藻細胞，每個濃度設3個平行。重懸藻液于-20℃下冷凍2 h后，室溫下融解，反復凍融3次，以5 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白含量。

2）超聲波破碎法：用10 mL PBS重懸不同濃度藻細胞，每個濃度設3個平行。冰浴下設定超聲波細胞粉碎機（JY92 IIN型，寧波新芝生物科技股份有限公司）參數為：超聲功率585 W，超聲時間5 s，間隙時間5 s，總提取時間20 min。破碎藻液以10 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白含量。

3）堿提法：參照韓謙等[25]對波吉卵囊藻多糖提取方法的優化條件，向不同濃度藻細胞的3個平行組中加入2 mL 0.305 mol/L NaOH溶液，于58.5 ℃下水浴68 min，以5 000 r/min離心10 min，取上清液測定蛋白含量。

1.2.1.2 波吉卵囊藻蛋白質含量測定 1）標準曲線繪制：采用考馬斯亮藍法以牛血清（BSA）為標準品制作標準曲線。分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL 200 μg/mL BSA，補蒸餾水至1.0 mL，加入5 mL考馬斯亮藍G-250染料（CBB），混勻，于室溫靜置5 min。取1.0 mL雙蒸水同上處理作為對照。用1 cm光程比色杯在UV-2450紫外分光光度計上測量595 nm處光密度（OD）值。以OD值為橫坐標，蛋白含量為縱坐標，繪制標準曲線，得標準曲線方程：= 168.77+ 5.5071，相關系數2 = 0.997 8。

2）不同方法提取波吉卵囊藻蛋白質：取1 mL不同方法提取得到的蛋白上清液與5 mL CBB染料混勻，室溫靜置5 min，在波長595 nm處測定OD值。根據標準曲線計算蛋白含量。

3）基于凱氏定氮法測定波吉卵囊藻蛋白質含量：根據GB/T6432-2018[26]的凱氏定氮法測定波吉卵囊藻粗蛋白含量，由廣東恒興飼料實業股份有限公司測定（廣東，湛江）。

1.2.1.3 波吉卵囊藻蛋白質得率及提取率計算 按照如下公式計算蛋白提取率：

蛋白得率（%）= (×A/B) /，

蛋白提取率（%）=蛋白得率/1.740%。

其中，為根據標準曲線計算的蛋白質質量濃度，μg/mL，A為提取液體積，mL；B為藻液體積，mL；為每mL藻液質量，μg；1.740為凱氏定氮法測得的粗蛋白質量濃度。

1.2.2 波吉卵囊藻蛋白質堿抽提法的優化

1.2.2.1 波吉卵囊藻蛋白堿抽提法單因素實驗 取藻液2 mL，以5 000 r/min離心10 min，棄上清液，藻細胞以等體積PBS清洗2次后待用。提取溫度實驗設置提取溫度為40、50、60、70、80和90 ℃共6個梯度，固定水浴時間為68 min，NaOH溶液濃度0.305 mol/L。堿濃度實驗設置NaOH濃度為0.15、0.20、0.25、0.30、0.35和0.40 mol/L共6個梯度，固定提取時間為68 min，水浴溫度為58.5 ℃。提取時間實驗設置提取時間5、20、40、60、80和100 min共6個梯度，固定NaOH溶液濃度為0.305 mol/L，水浴溫度為58.5 ℃。每組3個平行。

1.2.2.2 響應面法優化波吉卵囊藻蛋白堿抽提法

根據單因素實驗結果，取堿抽提法中提取溫度、NaOH濃度和提取時間3個變量，分別在三個不同的水平上分析變量之間的相關性，用得率作為實驗的響應值，利用Box-Behnken響應面分析法設計了個實驗[27-28]，計算如下：

= 2(– 1) +0，

其中，為因子個數，0為中心點數。中心點實驗設置重復5次。各因素水平(–1、0、+1) 的實驗共17次，實驗因素與水平見表1。

表1 響應面中心復合設計

響應變量與自變量之間的關系由二次多項式方程構成。采用多元反應分析方法，以蛋白得率最低為1.45%，產量最高為標準，推導出最佳條件。Design-Expert8.06軟件根據二次多項式模型分別作出提取溫度、NaOH濃度和提取時間之間相互作用的響應曲面圖和等高線圖。

1.2.2.3 氫氧化鈉對考馬斯亮藍檢測法的干擾實驗

為探究NaOH是否會干擾考馬斯亮藍染料和蛋白質的反應，按照表1的設計，對CBB染料單獨作用以及CBB染料分別與NaOH、BSA和NaOH-BSA混合物作用時的波長進行掃描，掃描間隔為0.5 nm/s，掃描波段為400 ~ 950 nm。

表2 氫氧化鈉對考馬斯亮藍檢測法的干擾實驗設計

說明：BSA質量濃度100 μg/mL；NaOH濃度0.35 mol/L。

Note: BSA mass concentration is 100 μg/mL, and NaOH concentration is 0.35 mol/L.

1.3 數據處理及分析

用Excel 2010處理數據，用統計軟件SPASS 19.0對數據進行單因素方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平= 0.05。

2 結果與分析

2.1 提取方法對波吉卵囊藻蛋白提取效果的影響

3種提取方法對波吉卵囊藻蛋白的提取效果見圖1。不同提取方法均可不同程度地破碎藻細胞并釋放蛋白質。其中反復凍融法的最高蛋白得率僅為0.182%，超聲波破碎法最高蛋白得率為1.280%，堿提法的蛋白得率在藻液體積為2 mL時最高，為1.587%。以凱氏定氮法測得的波吉卵囊藻粗蛋白質量分數（1.740%）為標準，以上3種方法的蛋白提取率分別為10.46%、73.55%和91.21%，堿提法的提取效果極顯著優于反復凍融法和超聲波破碎法（< 0.01）。

2.2 提取溫度對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

提取溫度對波吉卵囊藻蛋白提取效果見圖2。在40 ~ 60 ℃范圍內，波吉卵囊藻蛋白提取率隨溫度升高而顯著增加（< 0.05），當溫度大于60 ℃后，波吉卵囊藻蛋白提取率無顯著性提升，溫度在60 ~ 90 ℃時平均得率為1.505%，平均提取率為86.49%，顯著高于40 ~ 50 ℃（< 0.05）。因此60 ~ 90 ℃是波吉卵囊藻蛋白提取最適的溫度范圍。但高溫會破壞蛋白結構影響蛋白活性[29]，選擇70℃為波吉卵囊藻蛋白提取的適宜提取溫度。

“----” 表示凱氏定氮法測定的粗蛋白含量；不同字母表示各方法間差異有統計學意義（P < 0.05）

不同字母表示差異有統計學意義（P < 0.05）

2.3 NaOH濃度對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

不同NaOH濃度下，波吉卵囊藻蛋白提取率如圖3所示。NaOH濃度對波吉卵囊藻蛋白提取率影響顯著（< 0.05）。在氫氧化鈉濃度為0.15 ~ 0.35 mol/L時，NaOH濃度與波吉卵囊藻蛋白的提取率呈正相關，并在NaOH濃度達到0.35 mol/L時，蛋白的得率達到最大值1.716 %，提取率為98.62 %。當NaOH濃度超過0.35 mol/L 時，蛋白提取率顯著下降。單因素實驗表明，0.35 mol/L NaOH溶液為波吉卵囊藻蛋白提取的適宜堿液濃度。

2.4 提取時間對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

如圖4所示，不同提取時間對波吉卵囊藻蛋白提取率影響顯著（< 0.05）。隨著提取時間的延長，波吉卵囊藻蛋白的提取率呈先增加后平緩趨勢，在5 ~ 60 min增長顯著（< 0.05），60 ~ 100 min變化不顯著，提取時間在60 ~ 100 min內平均蛋白得率為1.518%，平均提取率為87.24%。增加水浴時間不能增加蛋白質的提取率，且水浴時間過長可能會引起蛋白的降解，因此60 min為波吉卵囊藻蛋白提取的適宜時間。

不同字母表示差異有統計學意義（P < 0.05）

不同字母表示差異有統計學意義（P < 0.05）

2.5 響應面法優化波吉卵囊藻蛋白堿抽提法

響應面實驗設計和結果見表3，方差分析結果見表4。

波吉卵囊藻蛋白得率（）受提取溫度（）、NaOH濃度（）和提取時間（）的影響，用Design-Expert8.06軟件對數據進行二次多項式模型擬合得到如下方程：

表3 響應面實驗設計及結果

表4 響應面回歸和方差分析結果

注：“+ +”表示< 0.01；“+”表示< 0.05；“–”表示> 0.05。

Notes: “++” means< 0.01; “+” means< 0.05; “–” represents> 0.05.

由表4可知，模型值6.496表示其重要性，模型＜0.05，因此模型是顯著的。模型決定系數2= 0.893 1，校正后決定系數2= 0.755 6，模型失擬項= 0.077 2 > 0.05，表明該模型可靠性較高，所獲得的二次回歸方程可較好地預測響應值，具有良好的擬合度，可用于波吉卵囊藻總蛋白提取率的預測。模型一次項表現出極顯著的差異，一次項、二次項2和二次項2表現出顯著差異，其他項差異均不顯著。由值判斷，堿抽提法中三因素對波吉卵囊藻蛋白提取率影響顯著性由大到小依次為提取溫度、NaOH濃度、提取時間。

2.6 響應曲面和等高線圖分析

提取溫度、NaOH濃度和提取時間之間相互作用如圖5所示。圖5的I、II和III中的等高線中心接近圓形，表明提取溫度、NaOH濃度和提取時間三者之間相互作用均不顯著。從圖5的響應面曲線圖的陡峭程度和等高線分布的密集程度可得，提取溫度對響應值影響最大，其次是NaOH濃度，而提取時間對響應值的影響相對較弱，與方差分析的結果一致。

I: 提取溫度和NaOH濃度之間相互作用的影響；II: 提取溫度和提取時間之間相互作用的影響；III: NaOH濃度和提取時間之間相互作用的影響

I: Effect of the interaction between the extraction temperature and NaOH concentration; II: Effect of the interaction between the extraction temperature and time; III: Effect of the interaction between the NaOH concentration and extraction time

圖5 各因素交互作用對波吉卵囊藻蛋白得率的響應曲面及等高線

Fig. 5 Response surface plots of the effect of factor interactions on protein yield rate of

2.7 最優提取條件的確定及驗證

根據響應面優化得到波吉卵囊藻蛋白質的最佳提取條件為提取溫度74.65 ℃、NaOH濃度 0.35 mol/L、提取時間68.86 min。在此條件下預測蛋白提取率為1.731%。根據實驗的可操作性，確定蛋白提取條件為提取溫度74.5 ℃、氫氧化鈉濃度0.35 mol/L、提取時間69 min。在此條件下對模型的預測參數進行3次平行驗證，得到蛋白提取率為1.726%，與模型預測值1.731%接近，相對誤差為0.29%，小于10%，此時蛋白提取率高達99.20%，表明用響應面分析法得到的參數（提取條件）可靠。

2.8 NaOH對考馬斯亮藍法的干擾

NaOH與CBB染料在無蛋白狀態下的相互作用，以及與BSA比較結果如圖6所示。在無蛋白情況下，與CBB單染料相比，在CBB染料中加入0.35 mol/L的NaOH后，其595 nm處光密度值雖顯著增加（< 0.05），但極顯著低于有蛋白情況下的測定值（< 0.01）。CBB染料中加入100 μm/L BSA后，595 nm處光密度值極顯著增加（< 0.01），符合CBB染料對樣品蛋白質的結合反應，而在此基礎上加入0.35 mol/L NaOH后，其595 nm處光密度值未增加（> 0.05），說明0.35 mol/L NaOH對考馬斯亮藍法檢測蛋白無顯著影響。

BSA 質量濃度100 μg/L，NaOH濃度100 mol/L

3 討論

3.1 提取方法對波吉卵囊藻蛋白提取效果的影響

目前，微藻蛋白批量制備的原料一般為更易保存的干燥藻粉，但批量制備時，需將藻粉溶解在溶劑中再進行蛋白質提取[30-31]，過程繁瑣，耗時較長。本研究旨在開發一種小規模、快速、相對簡單的波吉卵囊藻鮮品蛋白質提取及定量方法。

在定量蛋白質時，傳統的凱氏定氮法需消耗大量的實驗材料，而考馬斯亮藍法反應快速、靈敏，只需少量實驗材料即可檢測，因此，本研究以凱氏定氮法測定的粗蛋白含量為標準，采用凱氏定氮法測定總氮含量。所得結果不易受到干擾，是公認的比較準確的方法[32-33]。與其他研究相似[17]。

不同提取方法所得蛋白得率和提取率不同，不同藻類，適宜的蛋白質提取方法亦不相同。Meijer等[17]研究表明，小球藻蛋白最佳提取方法為超聲波破碎法，唐治玉等[34]指出，銅綠微囊藻（）蛋白可用破碎細胞的反復凍融法提取。這兩種方法并不適用于波吉卵囊藻，表明相對溫和的破碎方法并不能將具有膠被結構的波吉卵囊藻細胞破壞。堿提法在藻液體積為2 mL時釋放了波吉卵囊藻細胞91.21%的總蛋白質，說明強堿可破壞波吉卵囊藻細胞壁外的膠質包被及細胞壁，釋放出絕大部分蛋白質。堿提法的蛋白提取率隨藻液體積的增加而降低，呈負相關，原因可能是2 mL 0.305 mol/L NaOH溶液不足以裂解高密度的波吉卵囊藻細胞，因此應針對藻液濃度優化堿液的體積或濃度，以提高蛋白提取率。Rausch[13]在考察0.5 mol/L NaOH對3種微藻蛋白質提取率的影響時發現，細胞壁較易破碎的星桿藻（）可提取43% ~ 100%的蛋白質，而具有雙層胞壁的柵藻（）僅可提取5% ~ 75%的蛋白質，說明在探究提取藻類蛋白質最適條件的時候，還需針對各藻類物種進行優化。

3.2 提取溫度對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

隨著提取溫度的增加，波吉卵囊藻蛋白提取率呈先增加后平緩趨勢，說明在40 ~ 60 ℃溫度范圍內，溫度的升高促進了波吉卵囊藻細胞的破裂，蛋白質釋放增加。Rausch[13]指出，70 ~ 80 ℃是星桿藻蛋白提取率最高的溫度范圍，與本研究結果相似。但韓謙等[25]研究表明，溫度過高可能導致蛋白質在堿性環境下分解，蛋白質結構遭到破壞，進而導致蛋白提取率顯著下降。在提取淀粉含量較高的植物蛋白時，高溫造成淀粉糊化，提取時會因溶液黏度過大而導致蛋白提取率下降[29]，因此，本研究選擇最適的提取溫度為70 ℃。

3.3 NaOH濃度對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

隨著NaOH濃度的增加，波吉卵囊藻的蛋白提取率先增大后減小。據Meijer等[17]報道，小球藻在1 mol/L NaOH中煮沸后僅提取24%的總蛋白。本研究中，當NaOH濃度為0.35 mol/L時，波吉卵囊藻蛋白質提取率達到98%，說明0.35 mol/L NaOH可使波吉卵囊藻的包被變疏松，促進蛋白質的溶出。此外，在堿性條件下，蛋白質溶解性增大[35]，隨著NaOH濃度的增高，蛋白溶解度也增大，因而波吉卵囊藻蛋白提取率上升。但堿液濃度過高會導致蛋白質脫羧，氫鍵和二硫鍵斷裂，影響蛋白質的構象[36]，降低蛋白提取率，0.35 mol/L NaOH為波吉卵囊藻蛋白提取的適宜堿液濃度。

3.4 提取時間對波吉卵囊藻蛋白提取率的影響

隨著提取時間的延長，波吉卵囊藻蛋白提取率呈先增加后平緩趨勢。不同藻類的熱堿提取時間差異較大，細胞壁較為簡單的聚球藻只需10 min即可提取蛋白質，柵藻卻需90 min以上[13]。本研究中，波吉卵囊藻在60 min時有最大提取率，表明在一定的提取時間范圍內，堿液滲透到細胞內以致蛋白從藻細胞溶出，但在60 min后，反應體系中的堿液濃度不足以繼續分解細胞，因此增加水浴時間不能增加蛋白質的提取率。而且水浴時間過長會引起蛋白的降解，60 min為波吉卵囊藻蛋白提取的適宜時間。

3.5 NaOH對考馬斯亮藍法的干擾

考馬斯亮藍測定法是蛋白定量的最常用方法[23]。但是，某些化學藥物會干擾考馬斯亮藍染料和蛋白質的反應，如常用蛋白提取劑十二烷基硫酸鈉（SDS）、溴化十六烷基三甲基銨（CTAB）、類黃酮和兩性電解質等化學藥品[37-38]。本研究表明，0.35 mol/L NaOH單獨與CBB染料反應時會有假陽性吸收，NaOH-BSA混合物的吸收光譜也證實了不會干擾BSA與CBB染料的反應，說明0.35 mol/L濃度下NaOH溶液的加入對蛋白的檢測無顯著影響。

4 結論

比較反復凍融法、超聲波破碎法以及堿提法下波吉卵囊藻蛋白質的抽提率，結果表明，堿提法對波吉卵囊藻蛋白提取效果極顯著優于反復凍融法和超聲波破碎法。單因素和響應面分析法分析表明，對波吉卵囊藻蛋白提取率影響由大到小次序為提取溫度、NaOH濃度、提取時間。熱堿法提取波吉卵囊藻蛋白的最佳條件為NaOH濃度0.35 mol/L，提取溫度74.5 ℃，提取時間69 min，此時波吉卵囊藻蛋白得率為1.726 %，提取率為99.20 %。本研究開發了一種適用于波吉卵囊藻的快速、小規模且相對簡單的蛋白質提取方法，有助于分析在不同處理條件下波吉卵囊藻蛋白含量的變化，為波吉卵囊藻蛋白資源的研究與開發提供基礎。

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Comparison of Protein Extraction Methods and Optimization of Extraction Conditions for

HONG Ting, REN Jia-jia, ZHANG Ning, LI Chang-ling, HUANG Xiang-hu

（,,524088,;,,518000,;,524025,）

To explore the use of Coomassie blue rapid protein determination for different proteins extraction methods fromto quickly determine the protein content of.Using Kjeldahl method as standard, the Coomassie blue staining method was used to determine the protein content offreshly extracted by repeated freeze-thaw method, ultrasonic disruption method or alkaline extraction method. The extraction effects of each method were compared. Through single-factor tests and response surface methodology, the effects of extraction temperature, NaOH concentration and extraction time on the extraction rate ofprotein in alkaline extraction were investigated.The alkaline extraction method was significantly better than other extraction methods (< 0.01). In the alkaline extraction method, the effects of various factors on the extraction rate ofwere in the following order: extraction temperature > NaOH concentration > extraction time. The optimal conditions were as follows: extraction temperature was 74.5°C; NaOH concentration was 0.35 mol/L; extraction time was 69 min. The yield rate of protein was 1.726%, which was closed to the model predicted value of 1.731% with Kjeldahl method as the standard and the protein extraction rate reached 99.2%.Alkali extraction method is the best method for extractingprotein. The model established by response surface method can better predict the effects of extraction temperature, NaOH concentration and extraction time on the protein extraction rate of.

; protein extraction; rapid extraction; Coomassie blue staining method; response surface methodology

Q946.1；Q949.21+.7

A

1673-9159（2020）03-0056-09

10.3969/j.issn.1673-9159.2020.03.008

2020-01-19

深圳市大鵬新區產業發展專項資金“活性微藻制品產業化關鍵技術的研究與示范”

洪廷（1994―），男，碩士研究生，研究方向為水產養殖。E-mail:598909211@qq.com

李長玲（1966―），女，教授，主要從事水域生態和養殖環境研究。E-mail: ybcl901@126.com

洪廷，任佳佳，張寧，等. 波吉卵囊藻蛋白質提取方法比較及提取條件優化[J]. 廣東海洋大學學報，2020，40（3）：56-64.

（責任編輯：劉慶穎）