安普那韋與人血清白蛋白之間的相互作用

張楠 陳建波

摘 ?要： 在體外模擬人體生理環境，采用光譜法并結合分子對接技術，研究了安普那韋與人血清白蛋白（HSA）之間的相互作用.熒光光譜表明：安普那韋可以增強HSA的熒光強度.通過對結合常數和熱力學常數的計算可知，安普那韋和HSA之間的作用力主要是疏水和靜電作用力;紫外-可見光譜顯示：安普那韋能夠增加HSA的吸收峰強度，表明兩者之間發生了相互作用.三維熒光光譜也顯示：加入安普那韋后，HSA的斯托克斯位移從62 nm增加到了86 nm，說明安普那韋可以使HSA的微環境極性增加，疏水性減弱;從圓二色光譜的研究結果可知：隨著安普那韋的加入，HSA的α-螺旋結構含量從18.38%增加到了63.62%，說明安普那韋的存在改變了HSA的二級結構.分子對接研究結果表明：安普那韋與HSA的作用位點位于HSA的ⅡA結構域，而同步熒光光譜的分析進一步證明了這一點.研究結果為進一步研究安普那韋在體內與血清白蛋白的相互作用提供了一定的理論參考.

關鍵詞： 人血清白蛋白（HSA）; 安普那韋; 相互作用; 光譜法; 分子對接

中圖分類號： R 915 ? ?文獻標志碼： A ? ?文章編號： 1000-5137（2020）04-0398-07

Abstract： The interaction between Amprenavir and human serum albumin （HSA） was studied by spectrophotometry combined with molecular docking technology under the conditions of simulating human body environment in vitro.The results of fluorescence spectrometry showed that Amprenavir enhanced the fluorescence intensity of HSA.And the calculation of binding constants and thermodynamic constants proved the existence of hydrophobic forces and electrostatic forces.UV-Vis spectra indicated that the absorption intensity of Amprenavir-HSA was gradually increased，which suggests that there was interaction between Amprenavir and HSA.The change of Stokes shift was observed from 62 nm to 86 nm through three-dimensional spectra，which indicated that Amprenavir increased the polarity and decreased the hydrophobicity of HSAs microenvironment.Circular dichroism was used to calculate the content of α-helix structure of HSA as well.Results showed that α-helix structure increased from 18.38% to 63.62% after the addition of Amprenavir.It proved that the interaction between Amprenavir and HSA changed the secondary structure of the protein.The result of molecular docking study suggested that the interaction between Amprenavir and HSA mainly occurred at ⅡA domain of HSA.This was further confirmed by the analysis of synchronous fluorescence spectrometry.This research provided a theoretical reference for further studies of Amprenavir in vivo.

Key words： human serum albumin （HSA）; Amprenavir; interaction; spectrometry; molecular docking

0 ?引 ?言

人類免疫缺陷病毒（HIV）是一種以核糖核酸（RNA）為遺傳物質的艾滋病病毒，根據血清的分型，可將HIV分為Ⅰ型（HIV-1）和Ⅱ型（HIV-2）兩種類型.艾滋病又名獲得性免疫缺陷綜合癥，其感染性強、潛伏期長，是一種危害極大的傳染病.安普那韋具有一定的抗HIV-1和HIV-2蛋白酶的作用，通過阻斷HIV成熟所必需的蛋白質前體的分裂，來干擾病毒的生長過程，然后釋放出沒有成熟的、不具有傳染性的HIV病毒分子.如果長期地服用安普那韋，可以降低血液中的HIV的負荷，降低感染艾滋病的機率，對于延長生命，提高生活質量有一定的輔助作用[1-2].

人血清白蛋白（HSA）是人體血漿中含量最豐富的蛋白質，具有特殊的配體結合能力，能與外源、內源物質相結合，對于藥物分子轉運到被吸收部位以發揮效力有重要作用[3-5].近年來，有很多學者對HSA和小分子藥物的相互作用進行了研究.孫曉悅等[6]利用光譜法結合分子對接技術研究發現：呋喃西林可以靜態猝滅HSA的固有熒光，且兩者的相互作用位點在HSA的ⅢA亞結構域.PRAGNA等[7]利用熒光光譜法、紅外光譜法、圓二色譜法等研究了2，4-二乙酰基間苯三酚動態猝滅HSA的固有熒光，改變HSA的二級結構.研究HSA和藥物分子的相互作用對于了解藥物在人體內的轉運、分布、代謝以及作用機制等藥代動力學具有一定的參考價值[8].

目前，已有很多學者對于安普那韋的合成進行了相應的研究，但是尚未有人對安普那韋和HSA在人體內外的相互作用機制進行研究.對于藥物分子而言，它們在體內的分布與代謝主要取決于他們是否能和人體中主要的轉運蛋白HSA結合.目前為止，安普那韋與HSA的結合常數、結合位點數和作用位點尚未明確.本研究通過熒光光譜法，檢測安普那韋與HSA的相互結合，經計算得到結合常數和結合位點數等有關兩者相互作用的參數;利用紫外-可見光譜法及圓二色譜法，研究了兩者之間的相互作用對HSA結構的影響;還通過分子對接技術，預測了安普那韋與HSA之間的相互作用位點，并且結合同步熒光光譜法對分子對接預測的位點進行相應的驗證，對于研究安普那韋在人體內的轉運、分布、代謝，和對人體的作用機制以及艾滋病的治療具有一定的參考作用.

1 ?材料與方法

1.1 實驗材料

Cary Eclipse熒光分光光度計（美國Varian公司）;TU-1901紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）;J-815型圓二色譜儀（JASCO公司）;HSA（純度大于98.0%），上海源葉;安普那韋（純度大于98.0%），上海源葉;所用其他試劑均為分析純.

1.2 實驗方法

用pH值為7.4的Tris-HCl緩沖溶液配制HSA貯備液（1.0×10-4 mol?L-1）;用乙醇配制安普那韋貯備液（1.0×10-3 mol?L-1），置于4 ℃冰箱保存備用.在300～500 nm波段內掃描熒光光譜圖，設置激發波長為280 nm，發射與激發狹縫為5 nm;從蛋白質數據庫（PDB）獲得HSA的晶體結構（PDB ID：1H9Z），采用Autodock 2.5軟件進行分子對接.

2 ?結果與討論

2.1 安普那韋與HSA的熒光光譜

HSA的熒光主要來自色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），但是由于Phe含量比較低，Tyr的熒光在被離子化時幾乎被猝滅，因此HSA的固有熒光主要來自位于ⅡA疏水亞域的Trp 214殘基.當藥物與HSA發生相互作用時，Trp的環境的改變導致HSA的熒光強度有所改變[9].

根據表1所示，安普那韋與HSA的結合常數K比較大，說明兩者之間通過結合發生了相互作用;ΔG<0說明安普那韋與HSA的反應可自發進行;ΔS>0，ΔH<0說明兩者之間的作用力主要是疏水和靜電作用力[10].

2.2 安普那韋與HSA的紫外-可見光譜

在紫外-可見吸收光譜中，由于電子躍遷，HSA會有兩個特征的吸收帶.如圖2所示，隨著安普那韋的增加，HSA的兩個特征吸收峰的吸收強度逐漸增強，表明HSA與安普那韋發生了相互作用.

2.3 安普那韋與HSA的三維熒光光譜

圖3（a）是HSA的三維熒光光譜圖，圖3（b）為安普那韋加入后HSA的三維熒光光譜圖.由圖3可知：隨著安普那韋的加入，HSA的兩個峰的強度都有所增加，具體的峰值變化如表2所示.其中λex為激發波長，λem為發射波長，F為熒光強度.

由表2可知：在加入安普那韋之后，峰1和峰2的強度都有所增加，其中峰2的熒光強度增加較為明顯;峰2的斯托克斯位移從62 nm增加到86 nm，表明安普那韋的加入可使HSA的氨基酸的微環境極性增加，疏水性減弱[11].

2.4 安普那韋與HSA的圓二色譜

在圓二色光譜（CD）圖中，由于電子躍遷，HSA會在208 nm和222 nm處出現的兩個α-螺旋結構的特征吸收峰[12-14]，如圖4所示.安普那韋加入后使HSA在208 nm及220 nm處的負槽減小，通過計算得出：當HSA與安普那韋之間的摩爾比為1∶0，1∶5和1∶10時，HSA中的α-螺旋結構在HSA二級結構元件數量的占比分別為18.38%，50.94%和63.62%，表明安普那韋與HSA的相互作用使HSA中的α-螺旋結構含量增加，改變了HSA的二級結構.

2.5 安普那韋與HSA體系的分子對接

分子對接是一種預測藥物結構的主要工具[15]，本文作者利用分子模擬技術來預測蛋白質和藥物之間的作用位點和結合區域.Lys199和Arg222位于HSA的IIA結構域[16].如圖5所示，分子對接結果得到安普那韋與HSA的相互作用主要發生在Lys199和Arg222之間，可以預測安普那韋與HSA的相互作用主要發生在的ⅡA區域.

2.6 安普那韋與HSA的同步熒光光譜

圖6中，當Δλ=15 nm時，酪氨酸熒光強度隨安普那韋濃度的增加而降低;而當?λ=60 nm時，色氨酸的熒光強度隨安普那韋濃度的增加而升高.在兩者的同步光譜圖中，色氨酸的同步熒光光譜與圖1的熒光光譜的趨勢相符，說明了安普那韋與HSA的相互作用主要發生在色氨酸附近[17].同時也表明了兩者作用位點主要位于ⅡA區域，與分子對接的預測相符.

3 ?結 ?論

本文作者通過光譜法結合分子模擬技術，研究了安普那韋與HSA之間的結合常數、結合位點數、相互作用力以及相互作用位點等，為安普那韋在人體內的轉運、分布和代謝提供了一定的參考依據.熒光光譜表明安普那韋可以增加HSA的熒光強度;在298 K條件下的反應結合常數為2.44×107 L?mol-1，表明了安普那韋與HSA之間結合較為緊密;熱力學參數說明兩者之間的作用力主要是疏水和靜電作用力.紫外-可見光譜顯示安普那韋與HSA發生相互作用.三維熒光光譜的斯托克斯位移在加入安普那韋前后由62 nm增加到86 nm，說明安普那韋可以使HSA的極性增加，疏水性減弱.圓二色譜計算得到HSA的α螺旋從18.38%增加到63.62%，表明了安普那韋可以改變HSA的二級結構，使HSA的構象發生變化.用分子模擬技術預測了HSA與安普那韋之間的相互作用的位點主要位于HSA的ⅡA區域，并且通過同步熒光光譜證明了分子對接的預測，說明了安普那韋與HSA之間的相互作用位點主要位于HSA的ⅡA區域.

參考文獻：

[1] CABBAR F，BERKAY T S，GONCA D C，et al.Dental patients knowledge and awareness about transmission ways of acquired immune deficiency syndrome （AIDS） [J].Journal of Istanbul University Faculty of Dentistry，2016，50：19-26.

[2] VERONESE L，RAUTAUREAU J B，GILLOTIN C，et al.Single-dose pharmacokinetics of Amprenavir，a human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitor，in subjects with normal or impaired hepatic function [J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2000，44（4）：821-826.

[3] MAURYA N，MAURYA J K，SINGH U K，et al.In vitro cytotoxicity and interaction of noscapine with human serum albumin：effect on structure and esterase activity of HSA [J].Mol Pharm，2019，16（3）：952-966.

[4] PARRAY M U D，MIR M U H，DOHARE N，et al.Effect of cationic gemini surfactant and its monomeric counterpart on the conformational stability and esterase activity of human serum albumin [J].Journal of Molecular Liquids，2018，260：65-77.

[5] FANALI G，MASI A D，TREZZA V，et al.Human serum albumin：from bench to bedside [J].Molecular Aspects of Medicine，2012，33（3）：209-290.

[6] 孫曉悅，畢淑云，吳鋆，等.光譜及分子對接法研究呋喃西林與HSA的相互作用 [J].分子科學學報（中英文版），2019（2）：141-147.

SUN X Y，BI S Y，WU J，et al.Study on the interaction between nitrofurazone and HSA by spectroscopy and molecular docking [J].Iournal of Molecular Science，2019（2）：141-147.

[7] LAKSHMI T P，MONDAL M，RAMADAS K，et al.Molecular interaction of 2，4-diacetylphloroglucinol （DAPG） with human serum albumin （HSA）：the spectroscopic，calorimetric and computational investigation [J].Spectrochimica Acta Part A：Molecular and Biomolecular Spectroscopy，2017，183：90-102.

[8] 楊霧，易忠勝，楊露露，等.小分子與HSA相互作用研究方法的進展 [J].理化檢驗：化學分冊，2016（11）：1352-1358.

YANG W，YI Z S，YANG L L，et al.Progress of methods on the study of interactions between samll-molecules and human serum albumin [J].Physical Testing and Chemical Analysis Part B：Chemical Analysis，2016（11）：1352-1358.

[9] CUI F，ZHANG Q，YAO X，et al.The investigation of the interaction between 5-Iodouracil and human serum albumin by spectroscopic and modeling methods and determination of protein by synchronous fluorescence technique [J].Pesticide Biochemistry and Physiology，2008，90（2）：126-134.

[10] ROSS P D，SUBRAMANIAN S.Thermodynamics of macromolecular association reactions：analysis of forces contributing to stabilization [J].Biophysical Journal，1980，32（1）：79-81.

[11] LU Z，QI L，LI G X，et al.In vitro characterization for human serum albumin binding Sorafenib，a multi kinase inhibitor：spectroscopic study [J].Journal of Solution Chemistry，2014，43（11）：2010-2025.

[12] WANG Y，WU P，ZHOU X，et al.Exploring the interaction between Picoplatin and human serum albumin：the effects on protein structure and activity [J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2016，162：611-618.

[13] POURESHGHI F，GHANDFOROUSHAN P，SAFARNEJAD A，et al.Interaction of an antiepileptic drug，Lamotrigine with human serum albumin （HSA）：application of spectroscopic techniques and molecular modeling methods [J].Journal of Photochemistry and Photobiology B：Biology，2016，166：187-192.

[14] MIR M U H，MAURYA J K，ALI S，et al.Molecular interaction of cationic gemini surfactant with bovine serum albumin：a spectroscopic and molecular docking study [J].Process Biochemistry，2014，49（4）：623-630.

[15] MORRIS G M，LIM-WILBY M.Molecular docking [J].Methods in Molecular Biology，2008，443：365-382.

[16] ASCENZI P，FASANO M.Allostery in a monomeric protein：the case of human serum albumin [J].Biophysical Chemistry，2010，148（1/2/3）：16-22.

[17] SIDDIQI M，NUSRAT S，ALAM P，et al.Investigating the site selective binding of Busulfan to human serum albumin：biophysical and molecular docking approaches [J].International Journal of Biological Macromolecules，2017，107：1414-1421.

（責任編輯：顧浩然）