抗結核化合物的設計與合成

鄒順 段李平 許東芳 孫大志

摘 ?要： 針對日益突出的結核病（TB）藥物耐藥性問題，對抗結核藥物進行了合理的修飾，以增強其結核病治療的效果.以異煙肼（INH）為原料，與不同的異氰酸酯反應，成功制備了9種新型的不對稱取代脲類化合物，這類脲橋結構對結核分枝桿菌（MTB）中的半胱氨酸合酶具有抑制作用，合成的產物經質譜（MS）、氫核磁共振譜（1H NMR）等方法進行了分析表征.

關鍵詞： 抗結核; 半胱氨酸合酶; 脲橋; 合成

中圖分類號： O 625.67 ? ?文獻標志碼： A ? ?文章編號： 1000-5137（2020）04-0416-06

Abstract： In view of the increasingly prominent drug resistance of tuberculosis （TB） drugs，the rational structure modification of antituberculosis drugs can improve the efficacy of TB treatment.In this paper，nine novel asymmetric substituted ureas were successfully prepared by reacting isoniazid（INH） with different isocyanates.This kind of urea bridge structure has inhibitory effect on cystine synthase in mycobacterium tuberculosis（MTB）.The synthesized products were confirmed by mass spectrometry（MS） and nuclear magnetic resonance spectroscopy（1H NMR）.

Key words： antituberculosis; cysteine synthase; urea bridge; synthesis

0 ?引 ?言

結核病（TB）是一種感染了結核分枝桿菌（MTB）所引起的一種慢性傳染病，它嚴重危害著人類健康，素有“白色瘟疫”之稱[1-2].目前，世界衛生組織宣布TB不僅是一個全球性的公共衛生問題，也是嚴重的社會、經濟和政治問題[3].TB已經成為繼艾滋病及缺血性心臟病后，導致發展中國家成年人病死率較高的又一原因[4].根據全球各國的TB疫情狀況，2015年10月WHO重新修訂了全球TB高負擔國家名單，中國是30個高負擔國家之一[5].

隨著各類臨床常用藥物的使用，MTB的耐藥性也在不斷提高，這就為未來治療埋下了隱患，甚至對目前的一些治療情況造成了影響[6].耐多藥肺結核患者與普通肺結核患者相比，一是傳染危害更大，受感染者一旦發病即為原發耐多藥肺結核，且傳染期更長;二是治療費用更高，耐多藥/廣泛耐藥肺結核（XDR-TB）的治療需要二線抗結核藥物，治療時間長達2～3年之久，治療費用大約是普通肺結核的100倍[7].盡管異煙肼（INH）的耐藥性問題日益嚴重，但通過對該化合物進行合理的修飾，或許會得到對藥敏型和耐藥型的MTB，尤其是對XDR-TB均有效的新型抗TB藥物.因此，近年來藥物化學家對這類化合物一直進行著廣泛的研究[8].

隨著MTB標準菌株基因測序工作完成，蛋白質組學（Pro-teomics）已成為MTB功能基因組學研究的重要方法[9].ZONG等[10]通過比較XDR-TB臨床分離株與標準菌株MTB（H37Rv）蛋白表達的差異，得出潛在臨床藥物作用靶點的3個蛋白質：ATP依賴性假定蛋白Rv2623、半胱氨酸合酶和蛋白酶體.其中針對半胱氨酸合酶，BRUNNER等[11]發現N，N′-雙取代脲這類化合物能在一定程度上抑制半胱氨酸合酶的活性.

故本文作者采用INH為母體，與芳香異氰酸酯化合生成含有N，N′-雙取代脲這類結構的化合物，根據不同取代基修飾的芳香異氰酸酯，得到不同取代基修飾的目標化合物，如圖1所示.目標化合物具有N，N′-雙取代脲這類結構，對XDR-TB具有一定的抑制作用，在體內水解后生成INH，對H37Rv具有抑制作用，故目標化合物應是一種對普通TB與耐藥TB均有效的抗結核化合物.目標化合物結構由液相色譜-質譜（LC-MS）和氫核磁共振譜（1H NMR）檢測表征.

1 ?材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

乙腈（CH3CN）、無水乙醇，上海凌峰化學試劑有限公司;二氯甲烷、石油醚，上海潤捷化學試劑有限公司;INH、對甲苯異氰酸酯、對三氟甲基苯異氰酸酯、對甲氧基苯異氰酸酯、異氰酸酯對氟苯、對氯苯異氰酸酯、對溴苯異氰酸酯、3，4-二氯苯異氰酸酯、3，5-二氯苯異氰酸酯、3-吡啶異氰酸酯，國藥集團化學試劑有限公司.實驗合成所用主要試劑均為市售分析純級別，未經純化直接使用.

恒溫磁力攪拌器（馳久85-2），上海閔行虹浦儀器廠;手提式紫外分析儀（2FP），上海康禾光電儀器有限公司;熔點測定儀（B-540）、旋轉蒸發儀（R-300），瑞士步琪有限公司;分析天平（BSA224S），德國賽多利斯集團;質譜儀（LCQ Deca），美國Thermo公司;電子天平 （JA2003N），上海精密科學儀器有限公司.

1.2 目標化合物的合成及實驗現象

目標化合物的合成采用化學實驗合成法.在100 mL干燥的圓底燒瓶中，加入30 mL的乙腈及1.0 g的INH，充分搖蕩后，在恒溫磁力攪拌器上油浴加熱冷凝回流1～2 h.當INH完全溶解后，稱量1.0～2.0 g的不同芳基的異氰酸酯（ 加入的物質的量稍多于INH），并緩慢滴加至圓底燒瓶中，反應過程中觀察實驗現象并記錄.滴加完畢后繼續油浴加熱回流1～2 h，待溶液冷卻后，抽濾并用乙腈洗滌，烘干稱量，即得到目標化合物，并用熔點測定儀測量其熔點.加入不同芳基的異氰酸酯，得到產物a～h;當芳基取代基為吡啶（即3-吡啶異氰酸酯）時，得到產物i，如表1所示.根據反應物的不同，實驗現象也各不相同，如表2所示，產物產率都在70%以上，反應較為完全.

1.3 目標化合物的表征

1.3.1 MS的測定

MS由Thermo LCQ Deca 質譜儀測定.接通氮氣（N2）和氬氣（Ar），設定N2為7×105 Pa.檢查電源并打開儀器，待質譜儀自檢后，選擇Masslynx軟件中的離子模式.先注入調節儀器的標準樣品，調節靈敏度和分辨率后，進行樣品測定.

1.3.2 1H NMR的測定

首先進行樣品的制備，在核磁共振樣品管中放入2～5 mg樣品，并加入0.5 mL氘代氯仿及1～2滴四甲基硅烷（TMS），進行測譜，將含樣品的核磁共振管置入核磁共振儀中，測定1H NMR譜圖.

2 ?分析與討論

2.1 LC-MS分析

產物經LC分離后得以純化，以純物質形式進入質譜儀，可以充分發揮質譜法的特長，通過MS圖中最高的分子離子峰的質荷比與目標產物的相對分子質量比較，可以初步判定產物是否為目標產物.同樣根據LC圖的出峰數和各峰面積比可以知道產物的純度.

以產物a為例，結果如圖2所示.設計的目標化合物a的相對分子質量為270.26，根據MS圖（圖2）所示，MS所測樣品的分子離子峰的質荷比約為271.12，分子離子峰的質荷比與目標產物的相對分子質量基本相一致.即可初步證明產物即為目標化合物a.根據LC圖（圖3）所示，所合成產物純度較高，雜質峰較少，且雜質峰面積較小.

依據此方法分析其他產物的LC-MS結果，所測所有產物樣品的分子離子峰的質荷比與目標產物的相對分子質量基本都一致，即可初步證明產物即為目標化合物.除產物g，h和i，其他所合成產物純度較高，雜質峰較少，且雜質峰面積較小.產物g，h和i需進一步純化降低雜質含量，以排除雜質對藥效的影響.

2.2 1H NMR分析

以產物a為例，分析1H NMR譜圖信息（400 MHz，DMSO-d6），化學位移（δ）為10.66～10.49 （m，1H），8.81 （s，1H），8.79～8.72 （m，2H），8.26 （s，1H），7.88～7.75 （m，2H），7.41～7.29 （m，2H），7.12～7.01 （m，2H），2.23 （s，3H）.根據產物a的1H NMR圖譜信息，在δ為2.3處譜圖積分為3，對應設計目標化合物a中苯環上的甲基氫，在δ為7.12～7.01處積分為2，對應苯環上靠近甲基的2個氫，因為苯環上的H的δ在7～8，當與供電子基-CH3連接時，電子云密度增大，δ較小，δ為7.41～7.29應為苯環上另2個氫.而相應地，吡啶環上的N可視為強吸電子基，使δ偏大，δ為8.79～8.72處積分為2的2個氫是吡啶環上靠近N原子的2個氫，在δ為7.88～7.75處積分為2的2個氫則是吡啶環上另2個氫.δ為10.66～10.49，8.81及8.26處，積分均為1，對應目標化合物上脲橋的3個亞氨基上的氫.

綜合產物a的1H NMR譜圖信息和2.1節MS信息所得結論，可以確定所得產物即為設計目標化合物a.依此分析其他產物，可以確定所有所得產物均為目標化合物.

2.3 生物活性測試

在本研究中不作生物活性的詳細介紹，另在其他文獻中進行了藥物活性實驗的分析詳解.藥物活性實驗結果顯示本次合成的9種藥物均有著不亞于常用藥物的藥效，需進一步探究臨床效用.

3 ?結 ?論

本實驗得到的INH衍生化合物是INH與一系列異氰酸酯反應生成的不對稱取代脲類化合物.INH作為抗肺結核藥物已有50多年的歷史，仍具有良好的生物活性，但是抗藥性的產生無疑是一個亟需解決的問題.因此，近幾十年來，對INH及其衍生物的合成與應用研究從未間斷.在抗藥結核桿菌與標準結核桿菌之間的蛋白質差異中發現半胱氨酸合酶這一潛在的靶點，因此，本課題在現有INH藥物的基礎上，在其有效位點上進行結構優化和改進，合成了9種新型的N，N′-雙取代的脲類化合物.合成的產物通過熔點測定、MS、1H NMR等手段表征，表明產物即為所設計的目標化合物.合成的目標化合物在生物活性上不亞于常用藥物，并且合成轉化率較高.

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（責任編輯：郁慧，包震宇）