夾脊電針對兔退變腰椎間盤組織中caspase3、caspase9表達的影響

汪伯毅，鄒璟，黃國付

以椎間盤退變為始動因素的腰椎退行性疾病臨床多發，且易復發。退變基礎上，若伴隨有脊柱持續軸向負荷，易加速椎間盤老化、纖維環破裂，繼而出現影像學改變以及腰腿部不適癥狀。既往臨床醫生多關注腰椎間盤退行性疾病的癥狀處理，對于椎間盤退變機制的重視不夠，一定程度上影響了椎間盤退行性疾病的有效防治。一直以來，以針灸為主的中醫外治手段廣泛應用于腰椎退行性疾病的治療中，但針灸治療的機理尚不十分明確。近年來，研究者注意到細胞凋亡異常在椎間盤退變中作用關鍵[1]，細胞凋亡增加后椎間盤退變的發生和發展明顯加強[2]，而半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)家族在細胞凋亡過程中具有核心調控作用。能否探尋干預椎間盤細胞凋亡的手段值得廣大科研工作者研究。本研究擬觀察夾脊電針對兔退變腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達的影響，試圖從細胞凋亡角度探討電針防治腰椎退行性疾病的可能機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與器材與試劑 ①動物：本次實驗20只骨骼發育成熟的雄性新西蘭大白兔(月齡5～6個月，體質量3.0～4.0kg)均由武漢大學實驗動物中心提供(合格證書編號42000500005577)。開始實驗前大白兔均給與適應性飼養1周(武漢市第一醫院中心實驗室)。將20只實驗兔進行隨機編號后分為正常組、假模型組、模型組和電針組4個組別。每組各5只。②器材：東風汽車設備制造廠提供椎間盤軸向加壓造模器；實驗兔固定器為課題組成員自己制備；采用美國通用電氣公司生產的Signa HDx 3.0T磁共振器；采用南京濟生醫療科技有限公司生產的韓氏穴位神經刺激儀；針灸針為一次性，由蘇州醫療用品廠有限公司提供，規格0.30mm×25mm；切片機由上海徠卡儀器有限公司生產提供(RM2016)；采用上海福瑪實驗設備有限公司提供的DGX-9003B型烘箱；采用格蘭仕微波爐電器有限公司提供的P70D20P-TF型微波爐；采用北京六一儀器廠生產的WD-9405A型脫色搖床；采用重慶光電儀器有限公司提供的XSP-C204型普通光學顯微鏡；③試劑：PBS溶液(0.01M)；NaH2PO4(0.593g)；Na2HPO4(5.802g)；NaCl(17.0g)；去離子水(ddH2O，定容至2L)；10×EDTA修復液(谷歌生物，目錄號：G1010H2O2)；H2O2(國藥集團化學試劑有限公司，目錄號：1001218)；BSA(Roche，北京索萊寶科技有限公司分裝，目錄號：A8020)；抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(Dako Denmark A/S，REALTMEnVision+/HRP RABBIT/MOUSE，貨號：K5007)；Anti-Caspase-3 Rabbit pAb(GB11009-1)；Anti-Caspase-9 Rabbit pAb(GB11053-1)。

1.2 方法 ①實驗造模：參照研究者Kroeber[3]及黃國付等[4]的造模方法，先將實驗兔固定于多功能操作臺上，用10%水合氯醛(1mL/kg)在兔耳緣靜脈注射麻醉。麻醉成功后進行備皮，分別在實驗兔L4、L5椎體椎旁約1.5cm定位，稍后做1cm垂直切口，逐層分離肌肉直至椎體暴露，用克氏針(直徑1.5mm)垂直刺入兩椎體間，借助電鉆力輔助克氏針橫穿透椎體及對側皮膚，稍后對切口進行縫合。調整克氏針兩端使之平行，最后將自制軸向加壓造模器安裝于克氏針兩端，調整造模器為200N的壓力，加壓操作時間為28d(見圖1A～B)。術后給予實驗兔肌肉注射青霉素(4×106U，1次/d，連續5d)預防傷口感染。造模第28d拆除克氏針上的軸向加壓造模器，拔出克氏針，將實驗兔置于3.0T磁共振器上以評估造模成功與否。造模不成功的實驗動物予以剔除后補齊樣本量。②實驗方法:正常組(n=5)給予自然喂養，不予特殊處理；假模型組(n=5)實驗兔在L4、L5椎體間穿入克氏針，不予椎體間加壓，不做治療；模型組(n=5)在L4、L5椎體間穿入克氏針，然后施以軸向加壓造模器加壓，不做治療；電針組(n=5)在成功造模的第1d開始施以電針治療(見圖2)。治療方法：取下加壓造模器及克氏針，將實驗兔固定于多功能操作臺，參照《實驗針灸學》[5]中“實驗動物穴位標準定位”，用28號1寸長針灸針捻轉刺入兔L4-L5雙側夾脊穴(深度0.5～0.8cm)，待針下有沉澀感時連接韓氏穴位神經刺激儀(調頻波2/15Hz，強度1～2mA)，每天行1次針刺治療(時間20min)，治療周期(連續6d為1療程，療程間隔1d，共治療4個療程)。

圖1A～B 造模

圖2 電針治療

1.3 檢測指標 在造模后第28天各組5只實驗兔均行L4-5椎間盤MRI平掃，評估造模效果。我們將各實驗兔腰椎間盤DWI原始數據傳輸到處理工作站，應用軟件對原始數據進行處理，生成ADC偽彩圖。在ADC圖上，選取腰椎的中間層面，于L4-5椎間盤中間即在T2WI上觀察到的椎間盤髓核矢狀位的中央區選擇1個點ROI，并測量ADC值，每點重復測量3次，取平均值。MRI分級方案參照Thompson椎間盤退變病理分級：Ⅰ級，NP呈膠凍狀，AF排列整齊，透明軟骨樣CEP厚度均勻，椎體邊緣規則。Ⅱ級，NP邊緣出現白色纖維組織，AF纖維層之間出現粘蛋白樣物質，CEP厚度不規則，椎體邊緣有凸出。Ⅲ級，NP內出現固化纖維組織，AF與NP界限不清，AF內粘蛋白樣物質廣泛沉積，CEP可見灶狀缺損，椎體邊緣散在骨贅。Ⅳ級，NP內出現平行于CEP的水平裂隙，AF出現放射狀或環狀破裂，CEP的軟骨下出現灶狀硬化，椎體骨贅<2mm。Ⅴ級，裂隙貫穿AF和NP，CEP廣泛硬化，椎體骨贅>2mm。Ⅰ～Ⅴ級對應計1～5分統計。磁共振掃描之后處死實驗兔，取出椎間盤組織，并通過免疫組織化學檢測其中caspase-3、caspase-9表達的情況。將石蠟切片置于烘箱(65℃)中烘片2h，脫蠟至水，用PBS進行沖洗(時間5min，共沖洗3次)；將切片置于EDTA緩沖液中，通過微波進行修復，方式為中火至沸后斷電，間隔10min后再采用低火至沸的方式；自然冷卻后用PBS洗3次，每次洗的時間為5min；切片需阻斷內源性過氧化物酶(放入3%過氧化氫溶液，室溫下孵育10min)；PBS洗3次，每次5min，甩干后5% BSA封閉20min(封閉電荷)；把BSA液去除，每張切片加入一抗(50μl稀釋過)覆蓋組織，在4℃環境中過夜；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，每張切片加相應種屬的二抗50～100μl，在4℃環境中孵育50min；PBS洗3次，每次5min；去除PBS液，之后每張切片加新鮮DAB溶液50～100μl，通過顯微鏡來控制其顯色；顯色完全后，通過蒸餾水或自來水進行沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精分化(1s)，自來水沖洗，氨水返藍，流水沖洗；切片經過70%～100%梯度的酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹膠封固，其中每10min一個梯度。將切片放在普通顯微鏡下，調整好位置后觀察、采集圖片，每張切片選擇3個高倍鏡視野，鏡下棕色為陽性細胞，應用Image J圖像分析系統計數陽性細胞后再進行統計學分析。

2 結果

2.1 實驗動物造模情況 部分實驗兔在建立模型一周內出現一側耳廓部分缺失，考慮耳源靜脈注射損傷所致。造模后共10只實驗兔出現下肢活動欠靈活，4只實驗兔出現肢體癱瘓，3只實驗兔在造模后一周內死亡，肢體癱瘓及死亡的動物均予以剔除后補齊樣本量。各組實驗兔在造模及電針干預期間食欲正常，反應靈活，無肌肉萎縮，無蓬亂及感染。

2.2 4組實驗兔第28天椎間盤MRI比較 正常組實驗兔、假模型組實驗兔各椎間盤信號強度相當，均為均勻明亮的高信號；而模型組實驗兔和電針組實驗兔經過造模處理后椎間盤信號強度較相鄰正常椎間盤信號有所降低，有的椎間盤甚至出現黑色，表明造模成功。見圖3A～H。

圖3A～H 4組椎間盤MRI比較

2.3 4組實驗兔ADC值及MRI分級比較 與正常組同期比較，假模型組第28天 ADC值及MRI分級差異無統計學意義，模型組第28天 ADC值明顯下降(P<0.05)，MRI分級明顯上升(P<0.05)；與模型組同期比較，電針組第28天 ADC值明顯上升(P<0.05)，MRI分級明顯下降(P<0.05)。見表1。

表1 4組實驗兔干預第28天ADC值及MRI分級比較

2.4 4組caspase-3及caspase-9表達比較 與正常組同期比較，假模型組第28天 caspase-3及caspase-9表達差異無統計學意義；模型組第28天 caspase-3及caspase-9表達增強(P<0.05)。與模型組同期比較，電針組第28天 caspase-3及caspase-9表達下降(P<0.05)。見圖4A～C。

3 討論

正常椎間盤沒有血管組織供應其營養，主要依靠軟骨終板途徑進行營養供應。隨著年齡增長，椎間盤退變程度有所增加，髓核細胞數目會相應減少，含水量下降，合成細胞外基質的質量降低[6]。此時，若長期過度壓力施加于椎間盤，會加速軟骨終板的損傷，影響到椎間盤的營養物質供應及代謝廢物的排除，進一步加劇椎間盤退變,繼而引發腰椎間盤突出癥，退行性腰椎病。近年來，越來越多的學者[7-8]注意到細胞凋亡與腰椎間盤退變密切相關，隨著細胞凋亡增加，椎間盤內細胞數量減少，細胞外基質的生成減少，椎間盤基質原本生成與破壞的動態平衡受到沖擊，加速了椎間盤退變。目前研究[9]發現細胞凋亡受到多種信號通路調控，Caspase家族作為細胞凋亡通路中最重要的調控因子，在哺乳動物細胞凋亡啟動及執行階段起重要作用。Caspase-3是caspase級聯反應中最重要的凋亡執行因子，而caspase-9作為caspase-3的上游調控因子，與caspase-3共同在細胞凋亡中起到關鍵作用[10]。研究者趙英倫等[11]報道了腰椎間盤退行性病變患者血清caspase-3，caspase-9濃度明顯高于正常健康者，并且血清caspase-3，caspase-9濃度越高者腰椎間盤突出節段越多，進一步說明了凋亡因子caspase-3，caspase-9很可能跟腰椎間盤退變密切相關。而研究者Chen[12]注意到基因敲除動物模型中，抑制caspase-3的表達的實驗手段可顯著阻滯體內和體外的細胞凋亡。基于此，探尋可以有效減少椎間盤組織中caspase-3，caspase-9表達的手段，將為抑制椎間盤細胞凋亡，繼而延緩椎間盤退變提供可能。

目前臨床上針對腰椎間盤退行性疾病的干預手段較多，而諸多開放/微創手術，理療，藥物治療均不能從根本上阻止LDD的發生和發展。電針以其突出的療效一直活躍于LDD的防治中，且得到了國際社會的關注和認可[13-14]。夾脊穴位于背腰部，脊柱正中旁開0.5寸，與旁行的足太陽膀胱經和正中的督脈聯系密切，可通過調控兩經而治療腰痛。而現代研究[15]亦從解剖及神經體液調節角度證實了夾脊穴深刺緩解局部肌肉痙攣，平衡脊椎內外環境而治療腰痛。

本課題組前期的研究證實了電針對腰椎間盤退變性疾病有良好的治療作用，且能降低LDD引起的免疫反應[16-17]。本研究通過持續加壓裝置作用于實驗兔腰椎間盤，誘導模型兔發生椎間盤退變(符合人的自然退變征像)，繼而通過夾脊電針治療28d，觀察夾脊電針對兔退變椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達的影響，研究結果發現，造模成功后兔腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達較造模前明顯增強，表明椎間盤退變后，細胞凋亡增加，細胞外基質的生成減少，而電針夾脊穴干預28d后兔退變腰椎間盤組織中caspase-3、caspase-9表達明顯降低，表明電針夾脊穴干預有利于細胞凋亡因子表達下調。由此，我們推測夾脊電針通過下調凋亡促進因子caspase-3、caspase-9的表達來抑制椎間盤細胞凋亡，繼而糾正細胞外基質合成與分解的失衡，從而來達到延緩椎間盤退變的目的。這將為臨床應用針刺防治腰椎退行性疾病提供科學的理論依據。但夾脊電針具體通過哪個信號通路介導而抑制細胞凋亡有待我們進一步研究。