燥濕止瀉顆粒對大腸桿菌引起腹瀉小鼠血清和小腸組織中MPO的影響

王 哲 潘幫婷 遲長安 田莉莉

錦州醫科大學畜牧獸醫學院，遼寧錦州121001

由致病性大腸桿菌導致的仔豬大腸桿菌性腹瀉是臨床較為常見的傳染性疾病，也是危害養豬產業健康發展的主要疾病，發病率及死亡率逐年升高，給養殖業帶來了較大的經濟損失[1]。目前，臨床上治療由大腸桿菌引起的腹瀉主要應用抗生素，由于長期或不當使用抗生素藥物使細菌對藥物的敏感性降低，產生了嚴重的耐藥性和藥物殘留[2]。因此，采用中藥來預防和治療大腸桿菌導致的腹瀉具有很好的應用價值和前景。復合中草藥能反映出中藥學的特點和優勢，要比單味中藥的治療效果好[3]。本試驗通過燥濕止瀉顆粒保護性給藥后，經腹腔注射致病性大腸桿菌造成小鼠腹瀉，檢測血清及小腸組織中髓過氧化物酶的活性，以探討細菌性腹瀉時燥濕止瀉顆粒對炎性細胞在小腸組織浸潤的影響，揭示抗腹瀉的作用機制，以期為臨床治療大腸桿菌所引起的腹瀉提供理論數據和新的思路方法。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

健康昆明小白鼠，SPF 級，購于錦州醫科大學實驗動物中心，雌雄各半，體重達到22 g 左右進行試驗。

1.2 菌 種

豬源致病性大腸桿菌O101，菌株為CVCC231，購自中國獸醫微生物菌種保藏管理中心。

1.3 主要試劑

燥濕止瀉顆粒由本實驗室保存；白頭翁散（藥店購入）；酵母粉提取物（OXOID）；胰蛋白胨（OXOID）；髓過氧化物酶測試盒（購于南京建成生物工程研究所）。

1.4 試驗方法

1）大腸桿菌菌懸液的制備。將CVCC231 凍干菌株經培養后增菌培養2～3 代，挑選單個菌落接種于LB 液體培養基中，置37 ℃培養箱中培養3 h。OD 值在0.7～0.8 之間，采用平皿表面活菌計數法確定菌液濃度為8.6×108CFU/mL。

2）藥物配制。燥濕止瀉顆粒、白頭翁散，用滅菌蒸餾水稀釋，搖勻備用。

3）動物分組及給藥。將60 只小白鼠分為6 組，分別為燥濕止瀉顆粒（高、中、低）劑量組、陽性對照組、模型對照組和空白對照組（表1）。禁食12 h 后，燥濕止瀉顆粒高、中、低劑量組和陽性對照組保護性給藥，每只小鼠灌胃容量0.5 mL，每天灌服1 次，連續灌胃5 d。末次給藥30 min 后，空白對照組腹腔注射0.5 mL 生理鹽水，其余5 組每只小鼠腹腔注射0.5 mL O101 菌液建立腹瀉模型。

4）樣本采集。小鼠禁食不禁水12 h 后，從小鼠尾靜脈采血0.5 mL，分離血清，備用；用二氧化碳使小鼠死亡，無菌解剖取小腸組織200 mg，用預冷的PBS 沖洗干凈后放入液氮中保存備用。

5）血清和組織上清的制備及髓過氧化物酶（MPO）活性的測定。小鼠尾靜脈采血，室溫靜置30 min，4℃冰箱過夜，3 000 r/min 離心10 min 取上清，用0.5 mL 的離心管分裝，-20 ℃保存備用。按MPO 試劑盒說明書方法進行，先配制勻漿介質，稱取一定質量的小腸組織，按體積比1∶19 加勻漿介質，制備成5%的組織勻漿。然后按MPO 試劑盒說明檢測血清和小腸組織MPO 的活性。

6）數據統計與分析。應用SPSS 19.0 軟件進行統計，試驗數據表示為平均值±標準誤，使用ANOVA 多重比較分析中的LSD 檢驗（t檢驗）檢驗數據顯著性。

2 結果與分析

2.1 腹瀉模型建立及臨床癥狀

攻毒后，模型組小鼠精神極度沉郁，被毛逆立，卷縮于籠子一角，飲食欲減少至廢絕，腹式呼吸。排便次數增多，小鼠肛門周圍及尾部粘有黃色稀便，腹瀉率為100%。剖檢變化發現胃臌氣嚴重；十二指腸有散在出血點，腸系膜淋巴結腫脹，腸壁變薄易斷，呈半透明狀；腸管膨脹擴張明顯，內容物稀薄，呈水樣黃色，與文獻[4]相符。燥濕止瀉顆粒組和陽性對照組小鼠腹瀉癥狀輕微，精神狀態良好。空白對照組小鼠未出現腹瀉癥狀和其他臨床癥狀，剖檢未見異常。

2.2 小鼠血清及小腸組織中MPO 的活性變化

如表2所示，模型對照組與空白對照組相比小鼠小腸組織中MPO 的活性顯著升高（P＜0.01）；燥濕止瀉顆粒高、中劑量組與模型對照組相比小腸組織中MPO 的活性顯著降低（P＜0.05）。模型對照組和空白對照組比較血清中MPO 的活性顯著升高（P＜0.01）；燥濕止瀉顆粒高、中劑量組與模型對照組相比MPO 的活性顯著降低（P＜0.01）。從數據結果得出，燥濕止瀉顆粒能夠降低大腸桿菌引起腹瀉時小鼠血清及小腸組織中MPO 的活性。

表1 小鼠腹瀉試驗分組及給藥

表2 小鼠腸道和血清中MPO 的活性

3 討 論

髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）為含鐵溶酶體酶，是過氧化物酶家族的重要成員之一，主要存在于中性白細胞和單核-巨噬細胞中[5]。MPO 占中性白細胞蛋白質干重的4%，中性白細胞產生的MPO 占循環中MPO 含量的95%，MPO 活性的高低直接反映出中性白細胞的浸潤程度[6]。當中性白細胞在組織中大量浸潤時，MPO 活性明顯升高，因此通過檢測MPO 活性可以用來表述中性白細胞的浸潤程度，間接反應組織發生炎癥的程度[7-8]。

MPO 活性是評價中性白細胞在組織中浸潤程度的主要指標，MPO 表達與炎癥發生的嚴重程度呈正相關，檢測MPO 活性可作為腸道損傷程度的重要評價指標[9-10]。本試驗用燥濕止瀉顆粒預防性給藥后，腹腔注射致病性大腸桿菌誘導小鼠腹瀉，檢測血清和小腸組織中MPO 活性的變化，觀察能否抑制腹瀉早期炎性細胞在小腸組織的浸潤。燥濕止瀉顆粒主要是由黃連、黃芩、金銀花、蜘蛛香組成的中藥復方，主要用于抗炎、抗腹瀉等病癥，具有清熱燥濕、瀉火解毒、消食止瀉等功效。為了評價燥濕止瀉顆粒的藥效，本試驗檢測了燥濕止瀉顆粒對致病性大腸桿菌誘導的腹瀉小鼠血清和小腸組織中MPO的活性。試驗結果表明，燥濕止瀉顆粒高、中和低劑量組能夠降低MPO 活性，與模型對照組相比效果明顯。燥濕止瀉顆粒高劑量組與陽性對照組相比MPO 值偏低，說明高劑量燥濕止瀉顆粒可以明顯抑制腹瀉小鼠腸道炎性細胞的浸潤，對于小鼠腸道的保護作用優于陽性對照藥白頭翁散。當機體出現炎癥反應時，中性白細胞中的MPO 釋放到循環系統中，參與機體的炎癥反應[11]。同時，白細胞會跨內皮細胞遷移由血管壁穿過到達血管外形成炎細胞，在細胞因子的趨化下進入組織間隙造成組織浸潤，是機體感染和炎癥的基本反應[12]。

本試驗通過腹腔注射大腸桿菌建小鼠腹瀉模型，觀察到小鼠血清及小腸組織中MPO 活性明顯升高，而燥濕止瀉顆粒高、中劑量組可明顯降低腹瀉小鼠血清及腸道中MPO 的活性，與陽性對照組（白頭翁散）結果相近，說明燥濕止瀉顆粒能夠抑制炎性細胞在小腸組織的大量浸潤。揭示燥濕止瀉顆粒對腹瀉小鼠腸道具有一定的保護作用，這可能與其抑制中性白細胞浸潤有關。