農(nóng)田水樣中微囊藻毒素-LR拉曼檢測(cè)方法的研究

黃珊，孟輝*，曾昆，2，黃哲

（1.江蘇大學(xué)環(huán)境與安全工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2.江蘇大學(xué)環(huán)境生態(tài)研究所，江蘇 鎮(zhèn)江212013）

工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人類日常活動(dòng)產(chǎn)生的大量富含氮、磷的廢水進(jìn)入環(huán)境，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化，導(dǎo)致藻類大量繁殖，形成水華。我國(guó)近年來多次發(fā)生嚴(yán)重的水華，對(duì)我國(guó)的工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和人民健康構(gòu)成了極大的危害，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[1]。研究發(fā)現(xiàn)，受到藻類污染的天然水體中對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害的主要是微囊藻毒素（Microcystin）[2]，其是一類具有多種異構(gòu)體的環(huán)狀七肽化合物，具有很強(qiáng)的肝毒性及潛在的“三致”作用[3-6]，其中微囊藻毒素-LR（MC-LR）因分布最廣、毒性最強(qiáng)而備受關(guān)注[7-8]。因此，國(guó)內(nèi)外對(duì)飲用水及水產(chǎn)品中的MC-LR 制定了殘留限量標(biāo)準(zhǔn)，我國(guó)規(guī)定MC-LR 的限量標(biāo)準(zhǔn)為1.0 μg·L-1[9]。MC-LR理化性質(zhì)穩(wěn)定，常規(guī)處理方法不能將其有效去除[10-11]。MC-LR 不僅能夠直接污染水體，對(duì)水生生物造成危害，還能通過灌溉、施肥等方式進(jìn)入農(nóng)田土壤，被農(nóng)作物吸收富集，造成農(nóng)產(chǎn)品安全問題，對(duì)人類健康產(chǎn)生危害[12-14]。因此亟需建立可靠、便捷的方法對(duì)農(nóng)田水樣中的MC-LR進(jìn)行檢測(cè)。

目前對(duì)MC-LR 的檢測(cè)技術(shù)是儀器分析方法和免疫分析方法。儀器分析方法能夠精確定性定量，有賴于昂貴、精密的大型儀器，如高效液相色譜（HPLC）、液質(zhì)聯(lián)用（LC-MS/MS）等[15-18]，且對(duì)樣品前處理、檢測(cè)人員及環(huán)境要求較高，檢測(cè)效率較低，不適用于樣本的現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)，無法滿足環(huán)境中MC-LR 的實(shí)際監(jiān)測(cè)需求。基于特異性生物識(shí)別材料（抗體、核酸適配體等）的免疫檢測(cè)分析方法如酶聯(lián)免疫吸附分析方法（ELISA）、免疫傳感器分析方法被廣泛應(yīng)用于食品中MC-LR 現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)[19-22]，但是特異性生物識(shí)別材料直接決定了分析技術(shù)的檢測(cè)性能，而特異性生物識(shí)別材料制備成本高昂，周期較長(zhǎng)，成為制約該項(xiàng)技術(shù)的主要瓶頸。表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)作為一種新型分析技術(shù)，基本無需前處理，樣品需求量少，適用范圍寬，激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬，SERS 信號(hào)峰窄，特異性強(qiáng)，已被廣泛應(yīng)用于食品及環(huán)境分析檢測(cè)等領(lǐng)域[23-24]。本研究擬以表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)為檢測(cè)手段，建立能夠?qū)r(nóng)田水樣中MC-LR 進(jìn)行檢測(cè)的現(xiàn)場(chǎng)、快速、靈敏的檢測(cè)方法，為農(nóng)田水樣中MC-LR 的現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)測(cè)提供技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸（AuCl3·HCl·4H2O）：分析純，購(gòu)自天津市邁斯科化工有限公司，配制成1.0%的氯金酸溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；檸檬酸三鈉（C6H5Na3O7·2H2O）：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硝酸銀（AgNO3）：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制成1.0×10-3mol·L-1的溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；鹽酸羥胺（NH2OH·HCl）：分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，配制成0.04 mol·L-1溶液，4 ℃冰箱內(nèi)放置備用；對(duì)巰基苯甲酸（4-mercaptobenzoic acid，4-MBA）：分析純，購(gòu)自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；MC-LR：分析純，購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

AR224CN 電子天平，美國(guó)OHAUS 公司；QT-1 漩渦混合器，上海琪特分析儀器有限公司；C-MAG HS4磁力攪拌器，德國(guó)IKA 公司；BIOMATE 3S 紫外-可見分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo 公司；Tecnai12 透射電子顯微鏡，荷蘭Philips 公司；i-Raman Plus 高靈敏度便攜式拉曼光譜儀，必達(dá)泰克光電科技（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 拉曼光譜儀的參數(shù)設(shè)置

激發(fā)波長(zhǎng)780 nm，拉曼光譜波長(zhǎng)范圍：800～2 000 cm-1，功率300 MW，掃描時(shí)間20 s。

1.3.2 金種的制備

將50 mL（1 mmol·L-1）氯金酸溶液置于250 mL的圓底燒瓶中，加熱并劇烈攪拌，溶液沸騰后加入5 mL（38.8 mmol·L-1）檸檬酸三鈉溶液，溶液顏色由淺黃色變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)攪拌15 min，制備金種。

1.3.3 刺狀金納米顆粒的制備

采用金種媒介增長(zhǎng)法合成。在100 mL 的燒杯中加入40 mL超純水，依次加入1.6 mL 1%氯金酸溶液、2 mL 4×10-2mol·L-1NH2OH·HCl 溶液，室溫下劇烈攪拌，分別加入0、20、100、200、500μL 和1 000μL 的1×10-3mol·L-1AgNO3溶液，最后加入0.2 mL 金種，攪拌至反應(yīng)液呈棕色[25]。

1.3.4 刺狀金納米顆粒表征

使用紫外分光光度計(jì)和Tecnai12 透射電子顯微鏡對(duì)制備的金納米顆粒進(jìn)行表征。刺狀金納米顆粒的SERS 增強(qiáng)效果的鑒定：以4-MBA 作為探針分子，取1.0μL SGNPs 與1μmol·L-14-MBA 溶液依次滴在硅片上，晾干后使用便攜拉曼光譜儀進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)條件為：激發(fā)波長(zhǎng)為785 nm，掃描時(shí)間20 s。

1.3.5 SERS檢測(cè)方法的建立

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：取1.0 mg MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于1.0 mL 甲醇中，即為1.0 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光4 ℃保存。使用超純水制備0.001、0.01、0.1、1、10μg·mL-1和100 μg·mL-1，以三角狀金納米顆粒為基底，使用錫箔紙代替硅片，采用1.3.4 中的方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測(cè)

水樣的采集：以鎮(zhèn)江市內(nèi)運(yùn)糧河及古運(yùn)河灌溉水渠作為取樣點(diǎn)。采集深度為0.5 m，放入棕色玻璃瓶-20 ℃保存，一周內(nèi)檢測(cè)。

水樣的前處理：將水樣用0.22 μm 的濾膜過濾待用。

天然水體樣品添加回收試驗(yàn)：陰性天然水樣（取自鎮(zhèn)江市內(nèi)金山湖，參照使用LC-MS/MS 方法測(cè)定[26]）添加MC-LR 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，使其終濃度分別為0.1、1、10 μg·mL-1和40 μg·mL-1。使用1.3.5 的方法進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)水樣平行測(cè)定3次，計(jì)算添加回收率。

農(nóng)田水樣的檢測(cè)：分別在古運(yùn)河和運(yùn)糧河中游及下游取水口附近隨機(jī)采集2次水樣，使用1.3.5的方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品平行測(cè)定3次。

圖1 紫外-可見吸收光譜和透射電鏡圖Figure 1 UV-vis spectrum and TEM

2 結(jié)果與分析

2.1 不同形貌的金納米顆粒對(duì)SERS活性的影響

2.1.1 不同形貌的金納米顆粒的紫外表征和透射電鏡圖

所制金種粒徑約20 nm，最大吸收波長(zhǎng)為518 nm，加入氯金酸、鹽酸羥胺和一定體積的硝酸銀溶液后，其最大紫外吸收峰紅移，生成了新的納米粒子，透射電鏡顯示為刺狀的納米粒子。圖1 分別為本研究制備的金納米顆粒的紫外-可見吸收光譜和透射電鏡圖，球狀金納米顆粒、三角狀金納米顆粒、短刺狀金納米顆粒、長(zhǎng)刺狀金納米顆粒、星形金納米顆粒及海膽狀金納米顆粒的最大吸收波長(zhǎng)分別為600、612、724、762、798 nm和794 nm。

2.1.2 不同形貌的金納米顆粒的SERS表征

圖2 基于不同形貌的刺狀金納米顆粒的4-MBA SERS譜圖Figure 2 4-MBA SERS spectra of SGNPs with different morphologies

以4-MBA作為拉曼探針分子，研究金納米顆粒的SERS活性。如圖2所示，表征結(jié)果顯示除海膽狀金納米顆粒的SERS 活性較弱，其余刺狀金納米顆粒都表現(xiàn)出比球狀金納米顆粒更強(qiáng)的SERS 活性，其中又以三角狀金納米顆粒的SERS 活性最強(qiáng)，短刺狀金納米顆粒、長(zhǎng)刺狀金納米顆粒、星形金納米顆粒的SERS活性逐漸減弱。刺狀金納米顆粒因其表面的尖刺和粗糙的表面具有比球狀金納米顆粒更強(qiáng)的拉曼散射效應(yīng)，按照拉曼散射機(jī)理，長(zhǎng)刺狀金納米顆粒應(yīng)產(chǎn)生最強(qiáng)的SERS活性，但這又與三角狀金納米顆粒的SERS活性最強(qiáng)的試驗(yàn)結(jié)果相矛盾，可能是由于三角狀金納米顆粒與短、長(zhǎng)刺狀金納米顆粒相比相互之間更能緊密地貼合在一起，能產(chǎn)生很強(qiáng)的拉曼散射縫隙增強(qiáng)效應(yīng)。星形金納米顆粒和海膽狀金納米顆粒因表面刺狀物長(zhǎng)度和數(shù)量減少，尖端增強(qiáng)減弱，同時(shí)也沒有很強(qiáng)的縫隙增強(qiáng)，從而SERS 活性減弱。因此本研究選擇三角狀金納米顆粒作為拉曼增強(qiáng)基底建立檢測(cè)方法。

2.2 MC-LR的SERS檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

MC-LR 的拉曼光譜峰的振動(dòng)歸屬如表1 所示。圖3 為使用100 μg·mL-1MC-LR 溶液以SERS 活性最強(qiáng)的三角狀金納米顆粒為增強(qiáng)基底得到SERS譜圖。圖中5 條光譜，均出現(xiàn)了位于830、885、1 007、1 031、1 309、1 380、1 457 cm-1和1 640 cm-1處的SERS峰，它們均屬于MC-LR 的拉曼信號(hào)。在這些峰中，1 007 cm-1和1 309 cm-1處的峰最明顯，且其峰強(qiáng)與濃度有明顯的線性關(guān)系（圖4），因此選擇此特征峰作為本檢測(cè)方法的定量峰。

表1 4-MBA SERS光譜的譜峰歸屬Table 1 SERS shifts of 4-MBA

圖3 100μg·mL-1 MC-LR溶液以三角狀金納米顆粒為增強(qiáng)基底得到的SERS譜圖Figure 3 100μg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs

以三角狀金納米顆粒為增強(qiáng)基底分別測(cè)定了0.001、0.01、0.1、1 μg·mL-1和10 μg·mL-1的MC-LR標(biāo)準(zhǔn)品溶液的SERS 譜圖（圖5），1 007 cm-1和1 309 cm-1處MC-LR 濃度與峰強(qiáng)的線性方程分別為y=16.798x+47.959 和y=11.510x+114.825。方法檢測(cè)限為1.0μg·L-1。

圖4 MC-LR溶液的濃度與其分別在1 007 cm-1和1 309 cm-1處的SERS峰強(qiáng)度之間的線性關(guān)系Figure 4 The linear correlation diagram of SERS peak intensity at 1 007 cm-1 and 1 309 cm-1 with the concentrations ranging from 1μg·L-1 to 100μg·mL-1

2.3 農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測(cè)

測(cè)試結(jié)果如圖6 和表2 所示，本研究建立的檢測(cè)方法的回收率為80%～102%，符合檢測(cè)要求。MC-LR在農(nóng)田水樣中的最低檢測(cè)限為1.0μg·L-1。結(jié)果顯示該方法能夠應(yīng)用于農(nóng)田水樣中MC-LR的檢測(cè)。

應(yīng)用本研究建立的方法以及LC-MS/MS 方法對(duì)鎮(zhèn)江市內(nèi)運(yùn)糧河及古運(yùn)河水樣中的MC-LR 進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示（表3），本研究建立的方法與LC-MS/MS檢測(cè)結(jié)果基本一致，具有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.84。5 個(gè)樣本中，有兩個(gè)樣本中檢出MC-LR，檢出率為40%，含量最高為1.81μg·L-1。

3 討論

圖5 0.001、0.01、0.1、1μg·mL-1和10μg·mL-1的MC-LR溶液以三角狀金納米顆粒為增強(qiáng)基底得到的SERS譜圖Figure 5 0.001、0.01、0.1、1μg·mL-1and 10μg·mL-1 MC-LR SERS spectra of Au TNs

高效液相色譜法等大型儀器分析法需要對(duì)樣品進(jìn)行前處理，檢測(cè)方式依賴大型儀器及專業(yè)分析人員，檢測(cè)成本較高，無法滿足現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求。基于特異性生物識(shí)別材料（抗體、核酸適配體等）的免疫檢測(cè)分析方法被廣泛應(yīng)用于食品中MC-LR 現(xiàn)場(chǎng)快速篩選檢測(cè)，但是特異性生物識(shí)別材料制備成本高昂，周期較長(zhǎng)，成為制約該項(xiàng)技術(shù)的主要瓶頸。本研究建立的基于三角狀金納米顆粒的SERS檢測(cè)技術(shù)對(duì)農(nóng)田水樣中的MC-LR 進(jìn)行檢測(cè)，采用現(xiàn)場(chǎng)無標(biāo)記檢測(cè)技術(shù)，無需使用價(jià)格昂貴且難以制備的抗體或核酸適配體，僅依據(jù)MC-LR 可以產(chǎn)生強(qiáng)拉曼指紋峰的特性進(jìn)行檢測(cè)。表面增強(qiáng)拉曼光譜激發(fā)波長(zhǎng)范圍寬，SERS 信號(hào)峰窄，特異性強(qiáng)，其對(duì)于樣品制備沒有特殊要求，基本無需前處理，樣品需求量少，適合微量和痕量樣品檢測(cè)，同時(shí)，適用范圍寬，對(duì)環(huán)境要求低，極易測(cè)量含水樣品。本研究使用的便攜拉曼儀器不同于大型儀器，成本低，輕巧便攜，操作簡(jiǎn)便，對(duì)實(shí)驗(yàn)人員技術(shù)要求低，現(xiàn)場(chǎng)適用性優(yōu)異。

圖6 農(nóng)田水樣中添加0.1、1、10μg·mL-1和40μg·mL-1的MCLR溶液，以三角狀金納米顆粒為增強(qiáng)基底得到的SERS譜圖Figure 6 0.1、1、10μg·mL-1and 40μg·mL-1MC-LR SERS spectra of Au TNs added to irrigation water samples

表2 農(nóng)田水樣測(cè)量MC-LR的結(jié)果和回收率Table 2 Determination and recoveries of MC-LR in irrigation water samples

表3 環(huán)境樣品分析Table 3 Analysis of environmental samples

文獻(xiàn)中已報(bào)道過一些基于表面增強(qiáng)拉曼相關(guān)技術(shù)的毒素或農(nóng)藥殘留的檢測(cè)，但目前檢測(cè)領(lǐng)域的SERS 相關(guān)技術(shù)還屬于新興的研究領(lǐng)域，關(guān)于微囊藻毒素的相關(guān)檢測(cè)研究?jī)H有一篇[27]，檢測(cè)限僅為1.0 mg·L-1，遠(yuǎn)高于本研究1.0μg·L-1的檢測(cè)限。此外，目前研究中使用的SERS增強(qiáng)基底多為金、銀納米粒子，銀的拉曼增強(qiáng)效應(yīng)強(qiáng)于金，但易于氧化[28-29]。球狀金納米粒子穩(wěn)定易制備但增強(qiáng)效果差，金納米星、金納米棒等由于尖端效應(yīng)，其拉曼增強(qiáng)效應(yīng)遠(yuǎn)強(qiáng)于金，但這些結(jié)構(gòu)不易制備，在實(shí)際環(huán)境中不穩(wěn)定，易熟化[30]。本研究制備的SGNPs穩(wěn)定易制備，縫隙增強(qiáng)效應(yīng)較尖端效應(yīng)更顯著，具有很強(qiáng)的SERS活性。

本研究首次建立基于三角狀金納米顆粒的SERS檢測(cè)技術(shù)并對(duì)農(nóng)田水樣中MC-LR 進(jìn)行檢測(cè)，操作簡(jiǎn)便，現(xiàn)場(chǎng)適用性優(yōu)異，檢測(cè)限（LOD）為1.0 μg·L-1，回收率為80%～102%。該方法可適用于對(duì)水體中MCLR 的現(xiàn)場(chǎng)殘留檢測(cè)，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)中MC-LR 的殘留限量為1.0μg·L-1。鎮(zhèn)江市內(nèi)運(yùn)糧河和古運(yùn)河灌溉水樣的檢測(cè)結(jié)果顯示，MC-LR 的檢出率為40%，含量最高達(dá)1.81μg·L-1，檢測(cè)結(jié)果與LC-MS/MS比對(duì)，相關(guān)系數(shù)為0.84，可以進(jìn)行實(shí)際樣本檢測(cè)。

4 結(jié)論

（1）以4-MBA 作為標(biāo)識(shí)物比較不同形貌的SGNPs 的SERS 增強(qiáng)效果，其中三角狀的金納米顆粒SERS 增強(qiáng)效果最為明顯，作為本研究的SERS 增強(qiáng)基底。

（2）利用MC-LR 會(huì)產(chǎn)生拉曼特征峰的特性，使用基于表面增強(qiáng)拉曼光譜的檢測(cè)方法檢測(cè)農(nóng)田水樣中的MC-LR，用三角狀的金納米顆粒作為基底，檢測(cè)限（LOD）為1.0μg·L-1，回收率為80%～102%，滿足殘留檢測(cè)要求。

（3）基于GSNPs的表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)于農(nóng)田水樣中MC-LR 的檢測(cè)方法簡(jiǎn)便可靠，為現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)MC-LR提供了新的技術(shù)手段。