酒制對瑞香狼毒抗腫瘤活性及毒性反應的影響

李紅玲，宋美燕，馬昊然，陸藝蓓，馬曉莉，徐艷嬌

(1. 河北大學 醫學院，河北 保定 071000;2.河北大學 中醫學院，河北 保定 071000)

瑞香狼毒(Stellerachamaejasme),又名紅狼毒，藏藥名稱熱甲巴，是瑞香科狼毒屬植物，其干燥根可入藥.中醫圣典《本草綱目》、《名醫別錄》對狼毒的功效，均有記載：稱其有“破積聚”、“除脅下積癖”[1]之功效，能“治痰飲癥瘕”[2].瑞香狼毒包含多種活性成分(萜類、香豆素、黃酮類化合物、木質素、多糖等)，藥理作用包括抗腫瘤、抗菌、抗病毒、調節免疫等[3-4].多項研究結果顯示，瑞香狼毒對肺癌、乳腺癌、胃癌、肝癌、肉瘤等多種腫瘤細胞均表現出顯著的體內外抑制活性[5-8].

由于瑞香狼毒生品具有一定毒性，從而限制了其臨床應用.將狼毒生品炮制(如醋制、奶制、酒制等)后，通過改變其化學成分的含量，能起到減輕藥物毒副反應、增強藥理功效的作用.其中，酒制可以增加瑞香狼毒的破痞功能[9-11].

本研究通過動物實驗，比較了瑞香狼毒酒制品和生品對S180腫瘤細胞的體內抑制活性，并對其抗腫瘤作用機制進行了探討，從而為瑞香狼毒的藥物開發提供了實驗依據.

1 材料與方法

1.1 實驗材料及試劑

小鼠80只(4～6周)，昆明種，清潔級，雌雄各半，體質量(20±2)g，動物合格證編號：1811297，由河北醫科大學動物學部繁育，飼養于河北大學醫學部實驗中心.S180肉瘤細胞，由中國醫學科學院細胞資源中心提供.瑞香狼毒切片，馬曉莉教授鑒定為正品，安國市昌達藥材公司產品.

PBS磷酸鹽緩沖液(粉劑)，抗原修復緩沖液(EDTA法)，過氧化物酶阻斷液，封閉用山羊血清，Ki-67鼠抗人單克隆抗體(用PBS以體積比1∶100稀釋備用)及生物素標記通用二抗，DAB顯色試劑盒(20X)均為北京中杉金橋公司產品，Caspase-3兔抗人多克隆抗體(用PBS以體積比1∶100稀釋備用)為武漢博士德公司產品.

1.2 實驗儀器

倒置顯微鏡 (上海徠卡儀器有限公司)；電陶爐(上海元山電器工業有限公司)； 石蠟包埋機(上海徠卡)；撈片機(上海徠卡)；石蠟切片機(德國徠卡)；電熱鼓風干燥箱(北京市永光明醫療儀器有限公司)；微波爐(廣東格蘭仕微波爐電器制造有限公司).

1.3 實驗方法

1.3.1 瑞香狼毒的炮制及水煎液的制備

瑞香狼毒生藥200 g，用1 000 mL的60度紅星二鍋頭浸泡(時間不低于6 h)，再經文火加熱、烤箱40 ℃烘干至白酒完全吸收(200 g瑞香狼毒生品炮制后，質量減至194 g).酒制及生品瑞香狼毒各取100 g，分別加水1 000 mL，浸泡0.5 h后大火煮沸，小火慢煎0.5 h后紗布過濾留取藥汁.同法煎制第2次，將2煎藥液合并，經大火煮沸濃縮、冷卻離心去除藥渣后，得250 mL澄明狼毒水煎液.部分原液用蒸餾水分別做2倍、4倍稀釋，最后得藥物質量濃度分別為0.4、0.2和0.1 g/mL的瑞香狼毒生品及酒制品水煎液各100 mL，于4 ℃冰箱內保存備用.

1.3.2 S180荷瘤鼠建模、隨機分組、灌胃給藥及觀察指標

離心收集S180肉瘤細胞至1×107/mL，0.2 mL腹腔注射于4～6周昆明小鼠體內，建立S180腹水荷瘤小鼠模型.待接種7～9 d，小鼠腹水明顯時，抽取小鼠腹水.0.2 mL腹腔注射于另1只4～6周的小鼠體內進行傳代.取第3代腹水型荷瘤小鼠1只，于腹腔接種第9天抽取腹水，用無菌PBS進行稀釋，將其調整至細胞濃度為1.5×107/mL的細胞懸液(活細胞數大于等于90%).以每只0.2 mL的劑量，皮下注射于小鼠左側上肢腋下部位，干棉簽按壓片刻防止液體滲出.為保持瘤細胞活力，接種操作需在1 h之內完成.

昆明種小鼠80只，雌雄各半，體質量18～22 g.隨機抽取10只作為空白對照組，剩余70只進行S180皮下荷瘤造模.于造模第2天，將荷瘤小鼠按體質量隨機分成7個組：模型組、生藥低中高劑量組(藥物質量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g/mL)、酒制低中高劑量組(藥物質量濃度分別為0.1、0.2、0.4 g/mL)，每組10只，雌雄各半.

分組次日灌胃給藥，每只小鼠每日1 mL，連續給藥7 d.空白對照組、模型組給予生理鹽水；瑞香狼毒用藥組，分別給予低中高濃度的瑞香狼毒生藥及酒制水煎劑.

于造模日開始，密切觀察各組小鼠的飲食、飲水等情況，隔日測量體質量1次.造模第2日起，荷瘤鼠進行造模處超聲檢查，隔日1次.

1.3.3 指標測量

末次給藥24 h后，將各組小鼠稱質量后脫頸處死解剖，將瘤體、脾臟及胸腺取材并稱質量，按下列公式計算各組小鼠的抑瘤率、脾指數、胸腺指數.

抑瘤率=(模型組瘤質量-用藥組瘤質量)/模型組瘤質量×100%，

脾指數=脾質量(mg)/體質量(g)×10，

胸腺指數 =胸腺質量(mg)/體質量(g)×10[10].

多聚甲醛水(質量比4∶100)溶液固定腫瘤組織48 h后，依次經梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟包埋后制成石蠟切片.切片機切成4 μm薄片，于60 ℃烤箱內2 h烘干，進行HE染色并按試劑盒操作流程進行Ki-67、Caspase-3免疫組化(SP法)檢測[12].顯微鏡下觀察腫瘤組織HE及免疫組化染色結果.免疫組化結果鑒定標準為Ki-67陽性呈棕黃色，表達于腫瘤細胞的細胞核；Caspase-3陽性為黃褐色，表達于腫瘤細胞的胞膜或胞漿中.每組10只小鼠，每只小鼠取1張切片，每張切片取5個高倍視野(視野需完整且不重疊)計算得出每張切片的陽性反應率，公式為陽性率=陽性細胞數或陽性反應面積/腫瘤細胞總數或細胞總面積×100%.最后累計得出平均值.

1.4 統計學方法

實驗數據用SPSS19.0軟件進行分析處理，以均數±標準差表示，單因素、多因素及重復測量資料方差分析比較組內、組間差異，具有統計學意義的判定標準為P<0.05.

2 結果與分析

2.1 各組小鼠的抑瘤率、腫瘤體積、體質量、脾指數、胸腺指數比較

實驗結果顯示，瑞香狼毒生藥及酒制組小鼠的瘤質量均小于模型組，F=7.616(P<0.01)；生藥低中高劑量組小鼠的抑瘤率分別為34.80%、44.00%、33.18%，中劑量組最高(P<0.05)；酒制低中高劑量組小鼠的抑瘤率分別為46.80%、57.97%、54.95%，中劑量組最高(P<0.05).酒制瑞香狼毒組抑瘤率與同劑量的生藥組相比，結果具有統計學差異(P<0.05)，結果見表1.

小動物超聲檢查結果顯示：利用V=ab2公式計算各組荷瘤小鼠的腫瘤體積(a指腫瘤組織長度，b指腫瘤組織寬度).各組數據進行組內、組間對比分析，組內對比F=333.393，P≤0.001；組間對比F=2.687，P≤0.001，結果見表2.造模第8天，小動物超聲檢查可見小鼠造模區皮下有實質性的不規則低回聲區，其邊界欠清晰，回聲區內可見點、片狀的散在高回聲鈣化區，偶有液性暗區，結果見圖1.

小鼠的體質量增長曲線結果發現：自造模第7天起，各組小鼠的體質量組間差異明顯(P<0.05).與空白對照組相比，模型組及生藥低、中劑量組小鼠的體質量增長緩慢(P<0.05)；酒制各劑量組小鼠體質量略高于生藥組，但組間差異P>0.05，不具有統計學意義，結果見圖2.

模型組、生藥各劑量組小鼠的脾指數低于空白對照組，生藥高劑量組小鼠脾指數最低(P<0.05)；與空白對照組相比，酒制各劑量組小鼠的脾指數略高，但組間差異P>0.05，沒有統計學意義；酒制各劑量組小鼠的脾指數高于生藥組(P<0.05).各組小鼠的胸腺指數結果顯示，組間差異P>0.05，不具有統計學意義，結果見表1.

腫瘤組織的HE染色形態學觀察發現：模型組腫瘤細胞形狀不規則、大小不等，數量較多并且排列緊密；高倍鏡下可見多個增殖細胞，胞核較大且呈分裂狀、深染.瑞香狼毒各用藥組的腫瘤細胞較模型組相比，排列稀疏，數量較少，高倍視野下可見大小不規則的壞死區，區內呈淺粉色，正常細胞結構消失，無胞膜，胞核消失或可見散在的碎裂胞核，壞死區周圍有散在的、不同程度的白細胞浸潤(圖3).

圖1 各組荷瘤小鼠造模第8天腫瘤超聲影像Fig.1 Ultrasound image of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group on the 8th day of modeling

圖2 各組小鼠體質量增長曲線Fig.2 Mass growth curve of mice in each group

圖3 各組荷瘤小鼠腫瘤組織形態學觀察 HE染色(×400)Fig.3 Morphological observation of tumor tissue of tumor-bearing mice in each group HE staining(×400)

2.2 各組荷瘤小鼠Ki-67、Caspase-3免疫組化結果比較

免疫組化結果顯示，生藥及酒制瑞香狼毒各劑量組小鼠的Ki-67增殖指數明顯低于模型組(P<0.05，P<0.01).生藥低中高劑量組的Ki-67增殖指數分別為40.00%、29.23%、30.78%，中劑量組最低(P<0.05)；酒制低中高劑量組的Ki-67增殖指數分別為27.37%、26.50%、26.28%，高劑量組最低(P<0.05).酒制瑞香狼毒組Ki-67增殖指數與同劑量生藥組相比，具有統計學差異(P<0.05).

瑞香狼毒各用藥組小鼠的Caspase-3陽性表達率高于模型組，其中以酒制中高劑量組50.75%、40.40%的Caspase-3陽性表達率最高(P<0.01)，但生藥各劑量組、酒制低劑量組的Caspase-3陽性表達率與模型組相比，組間差異P>0.05；與生藥組相比，酒制各劑量組Caspase-3陽性表達率增高(P<0.05)，結果見表3.

免疫組化形態學觀察發現：DAB常規染色后，鏡下可見Ki-67陽性細胞呈現胞核棕黃色染色，模型組小鼠的Ki-67陽性細胞數量最多，生藥及酒制瑞香狼毒各劑量組數量相對較少，結果見圖4.Caspase-3陽性細胞的胞膜及胞漿呈現黃色或黃褐色，瑞香狼毒各用藥組的黃色顆粒數量明顯多于模型組，結果見圖5.

圖4 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Ki-67免疫組化結果(DAB×400)Fig.4 Immunohistochemical results of Ki-67 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

圖5 各組荷瘤小鼠腫瘤組織Caspase-3免疫組化結果(DAB×400)Fig.5 Immunohistochemical results of Caspase-3 in tumor tissue of tumor-bearing mice in each group(DAB×400)

3 結論

中藥炮制是在辨證論治中醫藥理論體系下所形成的一種中國特有的制藥技術.中醫理論認為：通過炮制，可改變藥材的四氣五味、升降浮沉、歸經等特性，從而導致其功效、用途發生相應變化，以達到辯證論治的用藥目的.中醫認為：酒，性味甘、辛，大熱，具有活血通絡、祛風散寒、引藥上行、緩和藥性、減毒等功效.多項研究結果顯示：酒精是一種良好的溶劑，能溶解多種物質，如糖類、生物堿、揮發油、甙類、鞣質、有機酸等.經酒精浸潤溶解后，能增強藥物有效成分的置換和擴散，從而達到提高藥物生物利用度的效果.本次實驗結果證實：酒制后的瑞香狼毒對S180腫瘤細胞的抑制作用優于生品，提示酒制能提高瑞香狼毒的破痞功能，起到抗腫瘤增效的作用.

與空白對照組相比，酒制瑞香狼毒組小鼠體質量組間差異P>0.05，而生藥組小鼠體質量增長減緩，可能與酒制能降低瑞香狼毒生藥的毒性反應相關.同時，酒制組小鼠的脾指數高于生藥組，提示酒制后的瑞香狼毒能提高小鼠的脾指數.該實驗劑量的瑞香狼毒對胸腺的影響不大(胸腺指數組間差異P>0.05)，結果不具統計學意義.

抑制腫瘤細胞增殖、誘導細胞凋亡是公認的中藥抗腫瘤的2種主要作用機制.采用免疫組化法，筆者對S180腫瘤細胞的增殖相關蛋白Ki-67、凋亡相關酶Caspase-3進行了定性和半定量分析[12].

腫瘤細胞的增殖，較正常細胞相比，具有不受控性.作為一個細胞增殖相關蛋白，Ki-67指數的高低，能體現細胞的增殖活性.其陽性率達到10%以上，則提示患有惡性腫瘤的可能性較高[13].研究顯示，Ki-67的陽性率與多種腫瘤的分化程度、浸潤、轉移及預后息息相關[14].實驗結果證實：與腫瘤對照組49.25%的陽性率相比，瑞香狼毒生藥組及酒制組的Ki-67增值指數明顯降低(P<0.05,P<0.01).酒制瑞香狼毒組Ki-67增殖指數與同劑量生藥組相比，具有統計學差異(P<0.05).實驗數據顯示，酒制瑞香狼毒通過抑制Ki-67在S180細胞中的表達，減緩腫瘤細胞分裂增殖.

細胞凋亡是一種真核細胞特有的細胞消亡現象，具有主動有序、多基因調控的特點[15].研究發現，多種酶蛋白、基因對凋亡的啟動調控具有調節作用.Caspase(含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶)家族，在細胞凋亡執行過程中具有不可替代的作用，是凋亡啟動的介導者和執行者.Caspase的激活，是公認的最佳凋亡生化標志.Caspase-3是凋亡最重要的執行者，是種類龐大的Caspase家族中最重要的效應型蛋白酶，處于凋亡有序級聯反應的下游[16].實驗結果證實,酒制中高劑量組Caspase-3的陽性表達率顯著性增高(P<0.01)，表明中高劑量的酒制瑞香狼毒能通過促進Caspase-3活化,誘導S180腫瘤細胞發生凋亡.