五種糖類對犬精液冷凍保存效果的研究

孫玲偉　戴建軍　吳彩鳳　張樹山　張德福

摘要：選取8只身體健康、性欲旺盛的比格公犬，采集其精液，對鮮精進行質量檢測，主要包括顏色、射精量、精子活率、活力和pH。選取精子活率達到70%以上犬精液用于后續精液冷凍試驗。分別將含有葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖的精液稀釋液與精液按照1∶2的比例進行稀釋。經冷凍解凍后，進行活率、活力、質膜完整性和頂體完整性的精子質量檢測。通過對新鮮精液進行品質檢測，結果顯示5只合格用犬的平均射精量為2.85 mL，密度為2.01×108個/mL，pH為6.56。含有果糖的冷凍稀釋液中精子活率和活力最高，分別達59.90%和54.00%;其次是添加葡萄糖和乳糖的稀釋液中活率較高，分別為59.21%和56.73%，且兩組稀釋液中精子解凍后活力均為52.00%。進一步評估精子解凍后質膜完整率，結果顯示葡萄糖和果糖組顯著高于其他組，分別達48.73%和49.52%;而蔗糖添加組精子質膜完整率最低，為42.21%。稀釋液中添加果糖的精子解凍后頂體完整率顯著高于其他組，而添加蔗糖組頂體完整率最低。在比格犬的精液冷凍保存中，添加果糖的冷凍稀釋液能顯著提高精子的活率和活力，從而達到提高凍精質量的效果。

關鍵詞：犬精液;冷凍;冷凍保護劑;糖類

中圖分類號：S814.3;S829.2? ? ? ? 文獻標識碼：A? ? ? ? 文章編號：1007-273X（2020）06-0010-03

人工授精是一項發揮優秀公畜遺傳潛力的重要現代動物生物技術，而精液冷凍是實現人工授精的重要技術環節[1]。目前，牛和羊等動物的冷凍精液已經商業化生產，廣泛用于人工授精和體外受精，進行優良品種的繁殖。然而，犬的冷凍精液保存效果較差，凍精解凍后精子活力低，用于人工授精后導致受胎率低、產仔數少等問題。犬的精液冷凍技術研究開始于1967年，美國對犬精液冷凍做了大量研究，并制定了冷凍精液生產及操作規程，然而因精子質量問題未得到廣泛推廣。有研究使用犬冷凍精液進行人工授精，其受胎率雖低于自然交配，但胎兒死亡率、先天性畸形率、初生重及性比例均與自然交配相似[2]。目前，在發達國家，犬的精液冷凍保存研究已經廣泛開展。我國對犬精液冷凍技術和人工授精技術研究始于20世紀80年代，目前尚處于試驗研究階段，生產實踐中并沒有普及和推廣。潘壽文等[3]報到了德國牧羊犬精液冷凍的研究，凍精人工授精成功。禹學禮等[4]對豫西土犬的冷凍精液和人工授精試驗獲得成功，受胎率達到57%，平均窩產仔3只。此后，李彩霞[5]、曹授俊等[6]、王素梅等[7]分別做了相關的研究，但凍精質量差、受胎率低一直是制約我國犬精液冷凍技術發展的重要因素。

在精液冷凍保存過程中，稀釋液中糖類物質不僅能為精子生存以及運動提供能量，也能提高精子凍后的活率以及頂體完整性。因此，本試驗旨在探尋葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖在比格犬精液冷凍中的添加，并研究其對凍精質量的影響，為犬精液冷凍產業化生產提供參考，促進犬精液冷凍技術更加成熟。

1? 材料與方法

1.1? 試驗動物

隨機選取上海交通大學農業與生物學院身體健康、生殖器官發育正常的雄性比格犬8只，年齡2～5歲。犬只單獨飼養在圍欄里，每天定時定量由固定飼養員飼喂全價種公狗糧，并提供新鮮飲用水，采集精液前1 h禁食。

1.2? 儀器與試劑

犬用集精杯、溫度計、電子分析天平、消毒鍋、離心機、磁力攪拌器、恒溫水浴鍋、光學顯微鏡、冰箱、0.5 mL凍精細管、液氮罐、一次性精子計數板（邁朗）、精子分析儀（邁朗，SJ-TMDI608）、便攜式pH檢測儀。

三羥甲氨基甲烷（Tris）、甘油、新鮮蛋黃、青霉素、鏈霉素、雙蒸水、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖等均由上海市農業科學院提供。

1.3? 方法

1.3.1? 精液處理

（1）精液采集。通過對試驗用犬為期2周的采精調教后，采用手握法收集精液。

（2）鮮精處理。精液采集后，立即記錄射精量、精液pH、精液顏色和氣味，之后進行精液品質分析，合格的精液進行下一步處理。只有射精量≥0.6 mL、精子密度≥2×108個/mL、精子活率≥70%的精液被用于后續試驗[8]。為排除個體差異，將合格的精液進行混合后，按照要求進行分組稀釋。

（3）精液稀釋液配方。根據以往文獻，在以Tris為基礎的傳統稀釋液中，分別添加葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖和海藻糖作為冷凍保護劑，配方列于表1[8-10]。之后檢測精液解凍后精子活率、活力、質膜完整率和頂體完整率。

（4）精液的稀釋與分裝。將經檢測合格的精液，在37 ℃下500 r/min離心10 min去除上層精清，將精液用5種稀釋液按照1∶1的比例進行稀釋，至最終度為200×106個/mL。將精液包裹8層紗布放置在4 ℃冰箱內降溫平衡2 h，分裝至0.5 mL凍精細管中，并做好標記。

（5）精液的冷凍與解凍。將凍精細管放置距離液氮上方4 cm處，利用液氮熏蒸法熏蒸15 min，之后投入-196 ℃的液氮中儲存，直到評估。解凍時，將凍精細管快速從液氮中拿出，放入37 ℃的水浴中，來回擺動，30 s即可解凍。將細管中精液收集至1 mL離心管中，37 ℃孵育30 min，隨后進行精液品質檢測。

1.3.2? 精液的品質檢測

（1）精子密度和精液pH。采用血細胞計數板進行測定。采用pH檢測儀進行精液的pH檢測。

（2）精子活率和活力測定。取解凍后精液樣品15 μL滴加在37 ℃預熱的一次性精子計數板上，在200×光學顯微鏡下隨機選擇4個視野，利用精子分析儀，自動識別運動精子、直線運動精子和死亡精子數量，經計算后形成活率和活力數據。其中，精子活率=運動精子數/總精子數×100%，精子活力=直線運動精子數/總精子數×100%。

（3）精子質膜完整率測定。采用低滲腫脹法（HOST）檢測精子質膜完整性。將9.0 g果糖和4.9 g檸檬酸鈉溶于1 000 mL蒸餾水中配置成HOST低滲溶液。將10 μL精液加入100 μL 37 ℃預熱的HOST低滲溶液中，37 ℃孵育40 min，取10 μL精液涂于載玻片上，晾干后在200×光學顯微鏡下隨機觀察4個視野，統計質膜完整和不完整的精子。其中，精子尾部有卷曲或精子膨脹為質膜完整精子;反之，則為質膜不完整精子。精子質膜完整率=膜完整精子數/總精子數×100%。

（4）精子頂體完整率測定。采用考馬斯亮藍法測定。將解凍后的100 μL精液加入500 μL 37 ℃預熱生理鹽水中，1 000 r/min 離心15 s后棄上清。加入500 μL多聚甲醛，室溫固定20 min，再次離心棄上清。通過PBS懸浮洗滌2次后，取10 μL樣品進行涂片，經空氣干燥后，滴加0.22%考馬斯亮藍染液，室溫靜置10 min。將染液洗滌干燥后，于油鏡下觀察頂體完整情況。每張抹片中觀察200個精子，并統計頂體完整的精子數。其中，頂體著色為均勻的藍色，代表頂體完整;反之，頂體著色淺或未染色，且邊緣不完整為頂體缺失或損壞。精子頂體完整率=頂體完整的精子數/總精子數×100%。

1.4? 統計分析

上述試驗均重復3次，所得數據采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，所有數據以平均值±標準誤表示，當P<0.05表示差異顯著。

2? 結果與分析

2.1? 比格犬鮮精品質檢測結果

本試驗共采集8只公犬的精液，進行精液品質檢測分析（表2）。其中1號、3號和6號的犬只精液檢測結果不符合后續試驗要求。故選用2號、4號、5號、7號和8號犬為試驗犬，采集精液后進行精液冷凍與凍后分析。通過對合格的5只犬新鮮精液進行品質檢測，犬平均射精量為2.85 mL，密度為2.01×108個/mL，pH為6.56。

2.2? 不同糖類對犬精子冷凍保存效果的影響

稀釋液中不同糖類物質對犬精子解凍后的精子活率、活力、質膜完整性和頂體完整性影響如表3所示。其中添加葡萄糖和果糖的稀釋液中精子解凍后活率最高，分別為59.21%±2.00%和59.90%±1.36%（P<0.05）;添加蔗糖和海藻糖精子解凍后活率較低，分別為49.52%±2.20%和49.52%±1.74%。通過檢測解凍后精子活力發現，僅添加蔗糖稀釋液的精子活力最低，為0.46%±0.01%，而稀釋液中添加其余4種糖類物質的精子解凍后活力差異不顯著（P>0.05）。進一步評估精子解凍后質膜完整率，結果顯示添加果糖的稀釋液組質膜完整率最高，為49.52%±2.12%，且與添加葡萄糖、乳糖和海藻糖差異不顯著（P>0.05），但添加蔗糖的精子質膜完整率最低，為42.21%±2.68%（P<0.05）。通過對各組凍后精子頂體完整率檢測發現，添加果糖組最高，為48.20%±1.80%，而添加蔗糖組最低，為40.59%±2.38%。

3? 討論

精液冷凍稀釋液中糖類物質作為非滲透性保護劑，在冷凍過程中能提高細胞外的滲透壓，從而避免細胞內水分向外流出而造成細胞脫水而皺縮，也能進一步減少細胞內冰晶形成，從而避免細胞遭受破壞[11]。此外，以往研究顯示稀釋液中糖類物質的添加能減少甘油對精子的毒害作用，從而提高精子活率和頂體完整率[12]。

作為反映精子運動狀態的重要指標，精子活率直接影響精子的受精能力，從而影響受精率。目前，不同國家對于解凍后精子活率和活力的標準不同，發達國家普遍要求均為35%以上，我國對解凍后的精子活率和活力要求均為30%以上[13]。稀釋液中添加的5種糖類物質后，犬精液解凍后精子活率和活力均超過國內外標準，說明5種糖類物質的稀釋液均能保證犬精子解凍后的受精能力。其中，添加果糖的稀釋液中犬精子凍后活率最高，葡萄糖次之。較多研究已經證明果糖和葡萄糖是精子的主要能量來源，但在犬的精液中沒有發現果糖和葡萄糖的存在。因此，外源性的添加果糖和葡萄糖能增加犬解凍后精子的能量代謝[13]。

精子質膜是在精子冷凍和解凍過程中最易受損傷的部位，也是影響精子受精能力的重要因素之一。精子質膜的完整性對精子維持自身新陳代謝、精子獲能和頂替反應等能力有直接關系[15]。本試驗結果表明，稀釋液中添加不同糖類物質對犬精子凍后的質膜完整率效果依次為果糖>葡萄糖>海藻糖>乳糖>蔗糖。稀釋液中添加糖類物質主要有兩方面作用，第一，糖類物質能提高過氧化物酶的活性，防止細胞質膜受到脂質過氧化，從而保持細胞膜通透性的穩定;第二，糖類物質具有一定黏性，能黏附在精子外圍，形成一個微環境，減少冷凍過程中形成的冰晶，從而防止冰晶對細胞質膜完整性的破壞[15]。此外，有研究顯示，蔗糖在哺乳動物精液低溫保存中，必須和滲透性抗凍劑聯合使用才能有效保護精子，這也進一步解釋了本試驗中稀釋液添加蔗糖組精子解凍后質膜完整性最低的原因[16]。

精子頂體中含有能影響精子受精能力的水解酶，若頂體結構受損傷而破壞，造成水解酶的丟失，直接影響精子的受精能力。保持精子完整性也是精子能夠完成頂體反應、穿過透明帶的必要前提[17]。目前，已經證明精子受到低溫應激后，會出現頂體異常，造成頂體完整率降低，一定程度上影響了精子的冷凍保存效果[18]。本試驗研究結果表明，稀釋液中添加不同糖類物質對犬精子凍后的質膜完整率效果依次為果糖>乳糖>葡萄糖>海藻糖>蔗糖。以往研究顯示，精液稀釋液中添加糖類物質，通過激光掃描共聚焦顯微鏡檢測發現其能增加細胞膜流動性，從而令精子頂體完整率得到提升[19]。本研究結果顯示，添加果糖組的精子凍后頂體完整率顯著高于蔗糖組，進一步說明果糖作為犬精液稀釋液相對于蔗糖更加具有優勢。

綜上所述，不同糖類物質對犬精子的冷凍保存具有不同程度的影響，綜合解凍后犬精子的活率、活力、質膜完整性和頂體完整性檢測結果，果糖作為犬的精液冷凍稀釋液是最佳的。

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收稿日期：2020-04-20

基金項目：上海市農口系統青年人才成長計劃[滬農青字（20l8）第l-22號]

作者簡介：孫玲偉（1987-），女，黑龍江伊春人，助理研究員，博士，主要從事動物繁殖學研究，（電話）17740813839（電子信箱）

sunlingwei1987@126.com;通信作者，張德福（1963-），男，上海奉賢人，研究員，博士，主要從事動物繁殖生物技術研究，

（電話）021-52235475（電子信箱）zhangdefuzdf@163.com。