6個(gè)Meckel-Gruber綜合征家系臨床和分子遺傳學(xué)分析

張蔓麗 王利群 李曉青 陳寧 潘亭亭 田亞平 盧彥平

Meckel-Gruber綜合征(Meckel-Gruber Syndrome，MKS)是一種罕見的常染色體隱性遺傳的初級纖毛病，造成的胎兒畸形涉及多種重要器官，屬于致死性畸形。MKS的發(fā)病率各國報(bào)道不一，由于近親婚配的原因，以阿拉伯國家最高，約1/1 300活產(chǎn)嬰，攜帶率1/18[1]，歐洲報(bào)道為2.6/10萬[2]。中國發(fā)病率不詳，僅見一些散發(fā)病例報(bào)道。MKS在胎兒發(fā)育的早中期即可出現(xiàn)典型的臨床表型，包括腦膜腦膨出、軸后性多指趾、雙側(cè)多囊腎等[3]。但不同MKS病例臨床表型并不完全一致，甚至有些表型與其他疾病如嬰兒型多囊腎(autosomal resessive polycystic kidney disease，ARPKD)等有重疊[4]，容易誤診。課題組前期設(shè)計(jì)了含有113個(gè)基因的初級纖毛病panel，結(jié)合二代測序技術(shù)，對6個(gè)MKS家系查找致病基因突變位點(diǎn)，以此為基礎(chǔ)提供遺傳咨詢，并為有生育要求的家庭進(jìn)行了PGD或產(chǎn)前診斷，幫助其獲得了無MKS疾病的下一代。

對象與方法

一、對象

1.6個(gè)MKS家系資料：收集2009年4月—2017年11月于中國人民解放軍總醫(yī)院婦產(chǎn)科就診的臨床診斷為MKS的6個(gè)家系。該6個(gè)家系夫妻雙方體健，均無遺傳病家族史。最后一次妊娠MKS胎兒時(shí)，妻子年齡均未超過35歲。6個(gè)家庭均于妊娠中期常規(guī)引產(chǎn)。家系資料見表1。

表1 家系資料Table 1 Pedigree data

夫妻雙方留取外周肘靜脈血，胎兒留取皮膚或肌肉組織。家系資料通過門診及住院病歷信息獲得。上述樣本和信息的收集均通過本院倫理委員會審查批準(zhǔn)，并獲得家屬知情同意。

二、方法

1.MKS胎兒的臨床診斷：MKS胎兒的臨床診斷依賴超聲結(jié)果[3]，通常包括多囊樣腎臟，并至少包括一個(gè)其他經(jīng)典特征，如枕骨腦膨出、多指趾畸形或肝臟發(fā)育異常(如肝膽管板畸形)。產(chǎn)前診斷超聲結(jié)果滿足上述條件即可臨床診斷MKS。

2.DNA提取：胎兒引產(chǎn)后立即留取直徑約3～5mm組織(皮膚、肌肉)提取gDNA。留取夫妻二人外周肘靜脈血各5ml。采用常規(guī)十六烷基三甲基溴化銨法(Cetyltrimethylammonium bromide,CTAB)提取血液樣本gDNA，采用通用柱式法提取組織樣本gDNA。嚴(yán)格按照試劑盒(MyGenostics,Chongqing,China)說明進(jìn)行。多余組織或血液均凍存于-80℃冰箱。

3.目標(biāo)外顯子結(jié)合高通量測序及結(jié)果判讀、驗(yàn)證：

(1)文庫構(gòu)建。上述提取的gDNA，采用MyGenostics文庫構(gòu)建試劑盒(MyGenostics Inc，Chongqing，China)，嚴(yán)格按照說明書操作。首先核酸片段化，末端修復(fù)，添加A尾。第二步進(jìn)行接頭連接。第三步連接產(chǎn)物純化。采用磁珠法純化產(chǎn)物。第四步PCR擴(kuò)增，隨后PCR產(chǎn)物純化，同樣采用磁珠法純化產(chǎn)物。

(2)目標(biāo)區(qū)域捕獲。此步采用含有113個(gè)基因的初級纖毛病panel進(jìn)行檢測。該panel針對纖毛病相關(guān)的113個(gè)基因的編碼外顯子區(qū)域及其側(cè)翼區(qū)域開展針對性捕獲富集，純化后的DNA保存在無酶水中。使用Qubit dsDNA HS Assay Kit對文庫產(chǎn)物進(jìn)行定量，使用Agilent 2100 Bioanalyzer system(Agilent DNA 1000 Kit)測定文庫片段長度。

(3)上機(jī)測序。將上述質(zhì)檢合格的文庫于Illumina Nextseq 500測序儀上進(jìn)行雙端測序。

(4)生物信息學(xué)分析。原始數(shù)據(jù)下機(jī)后保存為FASTQ格式，質(zhì)控后，使用cutadaptor軟件(http://code.google.com/p/cutadapt/)去除測序接頭、低質(zhì)量序列和短序列(<80bp)。使用BWA軟件(http://bio-bwa.sourceforge.net/)將質(zhì)控后的序列比對到人類基因組(UCSC hg19)序列上。使用picard工具(http://broadinstitute.github.io/picard/)去除數(shù)據(jù)中的重復(fù)序列。使用GATK軟件(https://software.broadinstitute.org/gatk/)的HaplotypeCaller功能獲得序列中的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotidepolymorphisms，SNPs)位點(diǎn)和小片段插入缺失(InDels)變異。使用GATK軟件的VariantFiltration功能完成變異位點(diǎn)的過濾。過濾后數(shù)據(jù)以VCF形式存儲并使用ANNOVA(http://annovar.openbioinformatics.org/en/latest/)軟件對上述變異進(jìn)行注釋，重點(diǎn)參考1000 genome,ESP6500,dbSNP ,EXAC,Inhouse (MyGenostics),HGMD等數(shù)據(jù)庫，以及PolyPhen-2,MutationTaster,SIFT,GERP++等軟件的預(yù)測結(jié)果。

(5)疑似位點(diǎn)的Sanger驗(yàn)證。對于panel測出的可疑位點(diǎn)，合成特異性引物，Sanger測序法用ABI3730xl測序儀(美國Applied Biosystems公司)以進(jìn)行測序，測序結(jié)果與目標(biāo)區(qū)域捕獲測序后的結(jié)果進(jìn)行比對，高通量測序及一代測序驗(yàn)證均由北京邁基諾基因科技股份有限公司協(xié)助完成。

結(jié) 果

一、6個(gè)家系MKS胎兒表型記錄

6個(gè)MKS家系，除家系1的第4名MKS胎兒和家系6的兩名MKS胎兒，其余MKS胎兒均表現(xiàn)出經(jīng)典的“三聯(lián)征”-枕部腦膨出、雙側(cè)多囊腎以及軸后性多指趾(見表1)。家系1的第4名MKS胎兒合并有先天性心臟畸形和唇腭裂。圖1為家系5的MKS胎兒大體解剖圖，提示該名MKS胎兒除經(jīng)典三聯(lián)征外尚有低位耳和短頸表現(xiàn)。

表2 6個(gè)家系MKS胎兒臨床表型Table 2 Clinical phenotypes of MKS fetuses fromsix families

Arrows in picture A point to different malformations on MKS fetus from family 5,including low-set ear,postaxial polydactylism and enlarged abdomen.Arrows in picture B point to occipital encephalocele.Picture D and E show postaxial polydactyly.Picture C and F show enlarged abdomen was caused by bilateral polycystic kidneys.圖1 家系5 MKS胎兒表型Figure 1 Clinicalphynotypes of MKS fetus from Family 5

二、二代測序及Sanger驗(yàn)證結(jié)果

對6個(gè)MKS胎兒進(jìn)行二代測序，其中為5個(gè)家系找到致病基因及其突變(見圖2)。其中家系3發(fā)現(xiàn)的兩個(gè)突變位點(diǎn)CC2D2A(c.347delA，p.E116fs；c.4463_4466del，p.S1488fs)、家系4 的CC2D2A(c.1326delC，p.Q443Rfs*15)突變位點(diǎn)以及家系5的TCTN2(c.343G>T,p.E115X；c.1540C>T,p.Q514X)兩個(gè)突變位點(diǎn)均未見報(bào)道，涉及突變類型為堿基缺失造成的移碼突變和堿基點(diǎn)突變造成的無義突變。上述致病基因的兩個(gè)等位基因突變均分別來源于父母，符合常染色體隱性遺傳模式。

三、6個(gè)家系妊娠結(jié)局

對上述6個(gè)家系進(jìn)行遺傳咨詢后，家系1進(jìn)入PGD流程，于2012年足月剖宮產(chǎn)一健康男嬰。家系2要求于外院行PGD，追訪未有結(jié)果。家系4要求于本院行PGD，待進(jìn)入流程。家系3、5要求自然受孕，家系3自然受孕后于外地建檔產(chǎn)檢，足月順產(chǎn)一健康男嬰。家系5成功受孕后于我院建檔，孕13周行超聲產(chǎn)前診斷提示胎兒發(fā)育正常，孕婦及家屬拒絕有創(chuàng)檢測，向其告知風(fēng)險(xiǎn)后定期常規(guī)產(chǎn)檢，均提示正常，于2017年足月順產(chǎn)一健康女嬰。隨訪至今家系1、3、5的三名幼兒發(fā)育正常。家系6失訪。

Picture A represents sequencing results for five families.Picture B,C and D respectively shows gene mutations in Family 2,3 and 4 sequenced by NGS,verified by Sanger sequencing.Due to the insufficient sample DNA from fetus,one of the gene mutations(CC2D2A c.347delA，p.E116fs) failed to be verified on fetus from Family 4 by Sanger sequencing.圖2 5個(gè)家系基因測序圖Figure 2 Sequencing results for five MKS families

討 論

MKS經(jīng)典三聯(lián)征包括多囊腎、腦膜腦膨出、多指/趾畸形。MKS的診斷是否需要同時(shí)滿足這三個(gè)表型，一直存在爭議[1,5]，因?yàn)椴煌±龍?bào)道中這三者的外顯率并不一致。來自于卡塔爾的MKS流行病學(xué)調(diào)查指出此三聯(lián)征在其病人中的檢出率分別為84.2%，92%以及52.6%[6]，而來自歐洲的人群調(diào)查報(bào)道MKS中多囊腎患病率為97.7%,腦膨出為 83.8%，多指趾87.3%[7]。本研究收集的6個(gè)MKS家系，雖然絕大多數(shù)患病胎兒表型出現(xiàn)了三聯(lián)征，仍有一名MKS胎兒沒有多指/趾畸形表型(見家系1)，出現(xiàn)該情況的原因可能與調(diào)控基因變異相關(guān)[8]。此外家系中有些MKS胎兒還出現(xiàn)了小下頜、心臟畸形、腭裂等表型。因此完全依賴臨床表型三聯(lián)征去診斷MKS存在很大風(fēng)險(xiǎn)，必須結(jié)合基因檢測進(jìn)一步明確診斷。

本研究利用二代測序技術(shù)為5個(gè)家系找到致病基因突變位點(diǎn)。OMIM記錄的MKS致病基因目前有13個(gè)，近年來TMEM237、CEP55也被報(bào)道與MKS樣的疾病相關(guān)[9,10]。家系3發(fā)現(xiàn)的CC2D2A兩個(gè)突變位點(diǎn)CC2D2A(c.347delA，p.E116fs；c.4463_4466del，p.S1488fs)、家系4 的CC2D2A(c.1326delC，p.Q443Rfs*15)突變位點(diǎn)以及家系5的TCTN2(c.343G>T,p.E115X；c.1540C>T,p.Q514X)兩個(gè)突變位點(diǎn)均尚未報(bào)道，突變類型為堿基缺失造成的移碼突變和堿基點(diǎn)突變造成的無義突變。CC2D2A基因位于4p15.32，編碼包含1620個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。該蛋白1020到1205位被稱為C2結(jié)構(gòu)域，在物種間高度保守[11]。本研究新發(fā)現(xiàn)的CC2D2A三個(gè)變異位點(diǎn)一個(gè)位于C2結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)位于N端，均涉及C2結(jié)構(gòu)域改變和C端蛋白喪失。中國漢族人中該基因C2結(jié)構(gòu)域和C端(1205-1620位氨基酸)單體型與智力障礙高度相關(guān)[12]，側(cè)面反映這兩段結(jié)構(gòu)與神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的重要關(guān)系。CC2D2A基因也是初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)(trasition zone,TZ)的重要蛋白，作為細(xì)胞“天線”存在的初級纖毛與腎小管發(fā)育密切相關(guān)[13]。因此CC2D2A基因移碼突變影響蛋白功能，進(jìn)一步導(dǎo)致腎小管上皮細(xì)胞初級纖毛異常，進(jìn)而導(dǎo)致腎臟囊性樣變[13]。目前對人類TCTN2基因研究和病例報(bào)道及研究極少，因此本研究對家系1[14]和家系5 MKS胎兒(數(shù)據(jù)未展示)腎臟病理切片均進(jìn)行HE染色，觀察腎臟結(jié)構(gòu)，結(jié)果與既往國外文獻(xiàn)報(bào)道類似，與其他基因相關(guān)的MKS嚙齒類動物模型腎臟病理改變無明顯區(qū)別。搜索gnomAD(http://gnomad.broadinstitute.org)數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)家系5位點(diǎn)TCTN2 c.343G>T，p.E115X突變尚無報(bào)道，而位點(diǎn)c.1540C>T ，p.Q514X人群等位基因頻率為4.063e-6。后續(xù)對TCTN2基因兩個(gè)新突變的功能試驗(yàn)提示無義介導(dǎo)的mRNA降解(nonsense-mediated mRNA decay，NMD)機(jī)制參與了這對截短蛋白的調(diào)控(數(shù)據(jù)未展示)。TCTN2、TMEM67基因亦位于初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)，多篇研究指出包括CC2D2A、TCTN2、TMEM67在內(nèi)的多個(gè)基因所編碼蛋白在初級纖毛轉(zhuǎn)化區(qū)形成NPHP 和MKS/JBTS 復(fù)合物，蛋白之間存在互作[15-16]，推測這些基因的改變有可能會不同程度的影響蛋白質(zhì)相互作用，從而影響共同的下游比如信號通路，造成某一類纖毛病。

通過初級纖毛疾病panel檢測，未能為家系6找到致病基因。分析原因可能在于存在此次纖毛病panel未涵蓋的致病基因或新基因、存在大片段缺失重復(fù)、致病位點(diǎn)測序質(zhì)量差、生信分析過程信息被過濾、致病位點(diǎn)在非編碼區(qū)等。2017年課題組再次使用全外顯子測序技術(shù)對此家系進(jìn)行分析，可惜的是仍未找到致病基因。對于此類家系，需要對測序數(shù)據(jù)每年進(jìn)行數(shù)據(jù)庫的再搜索，必要時(shí)使用全基因組測序。

綜上所述，對MKS疾病基因的檢測和致病突變的發(fā)現(xiàn)不僅豐富了MKS基因突變譜，為后續(xù)的遺傳咨詢奠定了基礎(chǔ)，為深入研究MKS為代表的纖毛病提供了新的案例和依據(jù)。