多抗霉素B組分的高效液相與質譜聯用的檢測方法

張楠高波潘忠成張心心郭秀艷翁婧李蒲民

(1.陜西麥可羅生物科技有限公司，陜西 渭南715500；2.哈爾濱工程大學材料科學與化學工程學院教育部超輕材料教育部重點實驗室，黑龍江 哈爾濱150001)

前言

多抗霉素又叫多氧霉素，在日本是從可可鏈霉菌素阿索變種(S.ca ca oi var.asoensis)中分離到一種核苷類抗生素[3,8]，而在我國是金色產色鏈霉菌(S.aurea chromogemes,4896)的次級代謝產物。多抗霉素屬于廣譜性生物殺菌劑，具有較好的內吸性傳導作用。其作用機理是抑制菌體細胞壁幾丁質的生物合成，使菌體細胞壁不能進行生物合成而導致死亡，還能抑制病菌產孢和病斑擴大[3,6]。多抗霉素主要用于蘋果斑點落葉病、梨黑星病、葡萄灰霉病、黃瓜霜霉病、番茄晚疫病、人參黑斑病等多種植物病害的防治[1-7]。有關金色產色鏈霉菌產多抗霉素的合成機理、多抗霉素合成基因簇、多抗霉素核苷骨架、金色產色鏈霉菌與其它鏈霉菌基因雜合產的次級代謝產物的研究，國內外已有大量報道[7-13]，但目前對多抗霉素B的分析方法主要是生物效價測定法，該方法操作復雜，耗時長、準確度低、精密度差，而且多抗霉素產品為多組分，生測法無法確認是多抗霉素哪種組分，只能測出其生物活性，不適合用于生產企業的質量控制和市場監督檢測。本文經過多次試驗，摸索出多抗霉素B的高效液相色譜法與質譜聯用的檢測方法。該方法在國內還未見報道，具有操作簡單快速、定量分析準確的優點，易于推廣。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

金色產色鏈霉菌(S.aurea chromogemes,4896)由陜西麥可羅生物科技有限公司菌種中心保藏。

1.1.2 發酵設備與條件

三級發酵設備購置于南京天匯生物科技有限公司，零級發酵罐總體積為5L，一級發酵發酵罐體積為30L，三級發酵罐體積為50L。每個發酵罐安裝消毒的空氣導管，消毒空氣由小型空氣壓縮機產生并由導管輸入至發酵罐(裝有空氣流量計)，消毒罐體的水蒸氣由蒸汽發生器產生并由導管輸入至發酵罐(中間裝有電磁閥、蒸汽計量計)，每個發酵罐裝有實時監控溶解氧、pH、溫度、轉速、補料、消泡和補酸堿系統。各級發酵罐的發酵培養基：玉米粉為0.3%，葡萄糖為0.35%，酵母浸粉為0.35%，KH2PO4為0.15%，CaCO3為0.45%，豆粕0.45%，魚粉0.13%，NaCl為0.15%，豆油0.015%，(NH4)2SO4為0.1%，GPE消泡劑0.006%，淀粉酶0.0005%，余量為滅菌水。批次接種量為發酵體積的10%～15%，零級發酵時間為30h，一級發酵時間24h，二級發酵時間為110h。二級罐發酵110h后的發酵液經12000rmp超速離心30min的上清液依次經陶瓷膜過濾(膜平均孔徑0.1μm，跨膜壓0.2～0.3mPa),過濾液再次經納濾膜過濾(截留分子量500以上的納濾膜)，截留液經噴霧干燥塔制得多抗霉素粗粉。

1.1.3 實驗儀器與試劑

高效液相色譜儀：waters高效液相色譜儀；質譜儀：Bruker 500MHz；玻璃器皿：50mL容量瓶；分析天平：梅特勒—托利多。

多抗霉素B標準品：自制，純度99.99%，將多抗霉素噴霧干燥的粗粉經活性碳脫色、去蛋白、離子交換樹脂去離子后經液相制備柱獲得多抗B純品；甲醇：色譜純；水：超純級；甲酸：分析純。

1.2 測試方法

1.2.1 液相色譜與質譜試驗條件

液相色譜柱：4.6mm×250mm，內裝C18填料；流動相：(配置1‰甲酸水溶液)，V水+V甲醇=95%+5%；柱溫：35℃，進樣體積：10μL；流速：1.0mL·min-1；檢測波長：260nm，停留時間8.5min。質譜測試：將10mg的多抗霉素標準品(樣品)N置于5mm核磁管中，加入0.50mL的D2O至管中，混合均勻后在Bruker500MHz設定好的條件下進行測試。

1.2.2 多抗霉素標準品溶液的配置

分別稱取多抗霉素B標準品約50mg至同一50mL容量瓶中，用水稀釋定容，然后分別用移液管取1mL至同一5mL容量瓶中，用水稀釋定容。

1.2.3 樣品溶液的配置

稱取含多抗霉素的樣品100mg至10mL容量瓶中，用水溶解并定容，用0.45μm濾膜過濾，備用。

1.2.4 定量分析

儀器達到平衡穩定后，以下列序列的形式進行標準品溶液、兩針樣品溶液、標準品溶液的定量分析，最終獲取多抗霉素BCN吸收峰的面積。

1.2.5 計算

多抗霉素原藥中多抗霉素B的質量分數ω1(%)按式(1)計算：

(1)

式中，ω1為試樣中多抗霉素B質量分數，以%表示；A2為試樣多抗霉素B峰面積；m1為標樣的質量，g；ω為標樣中多抗霉素B質量分數，以%表示；A1為試樣多抗霉素B峰面積；m2為試樣的質量，g；N為稀釋因子，n=25。

2 結果與討論

2.1 多抗霉素B標準品的質譜測試結果

稱取10mg的多抗霉素B標準品(樣品)置于5mm核磁管中，然后加入0.50mL的D2O至管中，混合均勻后在Bruker 500MHz設定好的條件下進行測試。具體測試結果如圖1。

從圖1可知，標準品中有效成分質荷比為508，多抗霉素B的分子式為C17H25N5O13，CAS19396-06-6；多抗霉素B分子量為507，從而可以確認制備所得樣品為多抗B樣品。

圖1 多抗霉素B標準品的質譜測試結果

2.2 有效成分分析的系統一致性

準確稱取標準品B 699.6mg(編號A1)，至50mL容量瓶中，用超純水稀釋定容。然后單獨進樣。

用移液管移取A1標準溶液各1mL于5mL容量瓶中，再用移液管移取2mL純水混合均勻，待用；A1稀釋3倍后連續6次進樣測試，具體測試結果見表1。

從表1可知，多抗霉素B保留時間相對標準偏差為0.79，峰面積相對標準偏差為0.94；證明系統一致性好。

2.3 線性響應的測定

濃度1樣品：用移液管分別移取A1標準溶液各1mL于5mL容量瓶中，再加2mL純水，混合均勻，待用。將A1稀釋3倍的樣品標號AD1；用移液管分別移取A1標準溶液各1mL于5mL容量瓶中，混合均勻，用純水定容，待用，將A1稀釋5倍的樣品標號為AD2；用移液管分別移取A1標準溶液1mL于10mL容量瓶中，混合均勻，用純水定容，將A1稀釋10倍的樣品標號為AD3；用移液管分別移取A1標準溶液1mL于25mL容量瓶中，混合均勻，將A1稀釋25倍的樣品標號為AD4；用移液管分別移取A1標準溶液各1mL于50mL容量瓶中，混合均勻，將A1稀釋50倍的樣品標號AD5。具體測試結果見表2和圖2。

表2 不同稀釋濃度的多抗霉素B高效液相測試結果

圖2 不同濃度的多抗霉素B與高效液相測試峰面積關系

從表2和圖2可知，多抗霉素B濃度與高效液相色譜測試的峰面積有很好的相關關系，其相關系數R2=0.9997。

2.4 精密度的測試結果

分別選擇有代表性的陜西麥可羅生物科技有限公司生產的3%多抗霉素可濕性粉劑和興農16%多抗霉素可溶粒劑，同一樣品，重復測定幾次，按1.2的操作條件進行測定，具體測定結果見表3。

從表3可知，陜西麥可羅3%多抗霉素可濕性粉劑中的多抗霉素B的變異系數為0.63%，興農16%多抗霉素可溶性粒劑的多抗B的變異系數1.03，進一步說明2種市場產品的多抗B的測定具有良好的精密度。由多抗霉素B高效液相測試圖3可知，兩者樣品的多抗B出峰時間為8.5min，在相同稱量值，兩者峰面積差別不大，進一步說明陜西麥可羅3%多抗霉素可濕性粉劑與興農16%的多抗霉素可溶性粒劑各自多抗B的含量占比差別不大。

表3 不同來源樣品的多抗霉素B高效液相測試結果

圖3 多抗霉素B的高效液相色譜圖

3 結論

試驗建立了高效液相色譜法檢測多抗霉素制劑樣品有效成分的分析方法。試驗結果表明，此高效液相色譜法在測試范圍內線性關系良好，方法精密度準確性良好，具有操作簡便、快速的特點，是產品質量控制和應用研究中較為理想的分析方法。