東莞地區慢性乙肝患者乙肝病毒基因分型及耐藥性研究

朱梓年，謝小燕，羅秀霞，丁愛嬌，張拔山

(東莞市人民醫院檢驗科, 廣東 中山)

0 引言

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)有一個非常顯著的特點，其屬于逆轉錄病毒類型，病毒因子在逆轉錄過程中因缺乏校對酶作用，很容易產生堿基錯配問題，進而累積形成多種基因型[1]。按照全基因序列同源性分類，乙型肝炎病毒包括B型、C型、D型等基因型，其分布有顯著的地域性特征，且不同的基因型對乙肝的發生、發展以及預后有重要影響[2]。鑒于此，本文將對東莞地區乙型肝炎患者乙肝病毒的基因分型和耐藥性進行檢測，結果如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年1月至2019年12月，選取在東莞市人民醫院就診的東莞地區的慢性乙型肝炎患者1175例，HBVDNA＞5.0IU/mL納入標準：①患者均與中華醫學會肝病學分會制定的《慢性乙型肝炎臨床診斷標準(2015 年)》相吻合[3]；②患者均知情，同意參與本次研究。排除標準：酒精性肝病、代謝性肝病及其他病毒感染導致的肝病等。其中，男789例，女386例，患者年齡18-65歲，平均年齡(35.6±2.4)歲。

1.2 檢驗方法

采用深圳亞能公司提供的應用基因擴增以及采用膜反向雜交技術(PCR-RDB)的成品試劑盒進行血清檢測，檢測內容為基因分型和耐藥突變情況。

晨起空腹抽取患者靜脈血3mL，置于促凝管中進行4 000 r/min 離心10min，分離血清并及時放到-40℃冰箱保存備用。嚴格按照深圳亞能公司所提供的試劑盒說明書進行操作，采用離心柱法提取乙肝病毒DNA，使用珠海黑馬HEMA 9600擴增儀進行擴增，PCR擴增條件設為：50℃ 2分鐘，1 cycles；95℃ 10分 鐘，1 cycles；94℃ 60秒，68 ℃ 90秒，30cycles ；94℃ 30秒，54℃ 30秒，72℃ 30秒，30cycles ； 72℃5分鐘，1 cycles。擴增產物加至含試劑盒膜條的雜交液中，在47℃環境中雜交1.5-4小時；洗膜，避光顯色15分鐘，結合藍色斑點判讀結果。

使用試劑盒膜條檢測區分中國和其他亞洲國家乙型肝炎病毒常見的B型、C型、D型基因。rt180M、rt204V、rt204I、rt207I、rt181V、rt236T六個突變位點。使用兩種膜條檢測耐藥性，主要檢測對拉米夫定、阿德福韋酯以及替比夫定的耐藥性。

1.3 觀察指標

1.3.1 統計上述乙肝患者乙肝病毒基因分型與突變分型。

1.3.2 統計B、C基因型對拉米夫定等常用藥物耐藥性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 21.0數據處理軟件進行綜合處理，計數資料以百分數和例數表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以均數±標準差，組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 上述乙肝病毒基因分型與耐藥突變分型

1022例陽性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，東莞地區乙肝病毒基因分型以B型和C型為主。見表1。

表1 乙肝病毒基因分型

1022例陽性感染病例中，出現rt180M突變161例，占15.8%，出 現rt204V突 變117例，占11.4%，出 現rt204I突變157例，占15.4%，出現rt207I突變9例，占0.9%，出現rt181V突變15例，占1.5%，出現rt236T突變34例，占3.3%。rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發生幾率最高。見表2。

表2 乙肝病毒突變點位

2.2 B、C基因型對拉米夫定等常用藥物耐藥性

B基因型發生拉米夫定耐藥性15.5%、替比夫定耐藥性15.5%，C基因型發生拉米夫定耐藥性37.6%、替比夫定耐藥性37.6%，差異有統計學意義，P＜0.05。見表3。

表3 B、C基因型對拉米夫定等常用藥物耐藥性分析

3 討論

按照核苷酸序列的異源性不同，可以將乙型肝炎病毒分為A-J十大類型，乙型肝炎病毒的基因分型呈現明顯的地域性特點，我國乙型肝炎病毒基因分型主要以B、C和D型為主[4]。有研究資料指出，我國南方地區的乙型肝炎病毒基因主要以B型為主，北方地區的乙型肝炎病毒基因以C型為主；漢族人群的乙型肝炎病毒基因以B型和C型為主，少數民族地區的乙型肝炎病毒基因A型和D型占比較多[5]。在本文研究的1022例乙肝陽性感染病例中，B型感染606例，占59.3%，C型感染410例，占40.1%，D型感染6例，占0.6%，東莞地區乙肝病毒基因分型以B型和C型為主，這也與上述研究結果相吻合。

乙型肝炎病毒感染之后的轉歸會受到多方面因素的影響，其中乙肝病毒基因分型是非常重要的指標[6]。有研究指出，乙肝病毒C型基因多導致嚴重病變，而乙肝病毒B型基因多引起輕度病變。其原因可能為乙肝病毒C型基因病毒的復制性較強、毒株致病性較強，不容易出現e抗原轉換，很容易出現持續的病毒血癥甚至較為嚴重的肝臟病變[7]。同時，乙肝病毒C型基因患者預后較差，這與乙肝病毒C型基因病毒血癥水平高、不易被清除有直接關系。

核苷酸類似物耐藥問題是乙肝治療中的關鍵問題之一，近年來，隨著核苷酸類似物等藥物的廣泛應用，該類藥物的耐藥菌顯著增多。有研究資料指出，在乙型肝炎的治療中，使用拉米夫定的一年耐藥率為24%，五年耐藥率為70%，使用阿德福韋酯五年耐藥率為29%，使用替比夫定兩年耐藥率為17%，乙肝病毒的耐藥性問題非常嚴重。耐藥性的增加會導致臨床療效喪失，增加臨床治療難度，患者發生肝硬化等嚴重并發癥的幾率也會增加[8]。在本文研究中發現，B型與C型均會出現耐藥性，C基因型發生拉米夫定耐藥性37.6%、替比夫定耐藥性37.6%，顯著高于B基因型的耐藥性，這與C基因型感染預后差有直接關系。臨床上，拉夫米定是治療乙肝病毒的常用藥物，其抗病毒機制明確、臨床應用廣泛，隨著該類藥物的普遍應用，拉夫米定耐藥性問題凸顯，誘發乙型肝炎病毒基因變異是導致拉夫米定耐藥的主要機理，一旦突變毒株成為優勢菌株后，其抗病毒效果會大打折扣，甚至毫無效果，嚴重的還會導致乙型肝炎病毒活躍、患者病情加重。本次研究還發現，rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發生幾率最高，故而在使用核苷酸類似物治療的過程中，必須及時開展基因耐藥突變檢測，更好地幫助醫生判斷病情、合理選擇藥物，這對改善患者預后有重要作用。

綜上所述，東莞地區乙肝病毒基因分型以B型和C型為主，rt180M突變、rt204V突變、rt204I突變發生幾率最高，C型耐藥性更強，對此應根據病毒基因分型選擇治療藥物，不斷改善患者預后。