鹽酸戊乙奎醚預(yù)處理對(duì)體外循環(huán)相關(guān)肺損傷大鼠肺表面活性因子的影響

體外循環(huán)（cardiopulmonary bypass，CPB）技術(shù)是目前施行心內(nèi)直視手術(shù)的必備條件和保障措施。急性肺損傷是CPB 術(shù)后最常見(jiàn)的并發(fā)癥之一。肺泡表面活性因子（pulmonary surfactant，PS）[1]是主要由肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞分泌合成的脂質(zhì)成分為主及表面活性蛋白（surfactant associated proteins，SP）為輔的復(fù)合活性物質(zhì)，在體外循環(huán)時(shí)低通氣量、低灌注血量、部分肺泡萎陷、通氣血流比例失調(diào)均會(huì)導(dǎo)致肺泡表面活性因子代謝障礙。目前發(fā)現(xiàn)肺泡表面活性因子的含量與肺泡功能及免疫屏障相關(guān)。

在體外循環(huán)過(guò)程中肺組織需經(jīng)受低血流量灌注、紅細(xì)胞稀釋、乏氧狀態(tài)、血漿滲透壓降低、平流灌注等多項(xiàng)非生理環(huán)境的刺激，尤其是嬰幼兒未成熟的肺組織耐受能力差，術(shù)后更易出現(xiàn)急性肺損傷，嚴(yán)重者出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征，需要再次氣管插管或待機(jī)延長(zhǎng)，影響患兒預(yù)后[2]。因此選擇一種能夠預(yù)防性應(yīng)用的干預(yù)措施以減輕CPB 相關(guān)肺損傷是目前研究的熱點(diǎn)，而鹽酸戊乙奎醚針對(duì)肺表面活性因子的保護(hù)作用及機(jī)制目前研究較少。本研究在實(shí)驗(yàn)中建立體外循環(huán)肺損傷大鼠模型[3]，通過(guò)預(yù)處理的給藥方式探討鹽酸戊乙奎醚針對(duì)肺表面活性因子的保護(hù)作用及機(jī)制，為臨床應(yīng)用該類(lèi)藥物提供動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图袄碚撘罁?jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與分組選擇成年（12～18月齡）健康SD大鼠（350～400g）30 只，由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供[許可證號(hào)：XXSYXK（豫）2019-001139；動(dòng)物合格證號(hào)：0132478791]，按隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=10）：對(duì)照組（Control 組）、體外循環(huán)組（CPB組）、鹽酸戊乙奎醚預(yù)處理組（PHC 組）。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與材料小動(dòng)物呼吸機(jī)（上海玉研儀器公司），體外循環(huán)血泵及配套硅膠管（polystanA/S，Denmark），變溫器（西京醫(yī)療器械公司），18G、24G靜脈留置針（安通醫(yī)療器械公司），動(dòng)脈壓力換能器（河南駝人醫(yī)療器械公司），微量泵（武漢科爾達(dá)醫(yī)療科技有限公司），動(dòng)脈血?dú)夥治鰞x及配套試管（美國(guó)強(qiáng)生公司）；IL-6/10 ELISA 試劑盒（上海篤瑪生物科技有限公司），SP-A/D ELISA 試劑盒（焦作路非凡生物科技有限公司），鹽酸戊乙奎醚注射液（成都力思特制藥股份有限公司），SP-B 一抗（上海瑞齊生物科技有限公司），SP-C 一抗（上海恪敏生物科技有限公司），山羊抗鼠二抗（艾美捷科技有限公司），PBS 粉（北京雷根生物技術(shù)有限公司），硫酸魚(yú)精蛋白（青島康原藥業(yè)有限公司），肝素鈉注射液（上海源葉生物有限公司）。

1.3 體外循環(huán)模型建立各組大鼠應(yīng)用10%烏拉坦8ml/kg 腹腔注射麻醉，大鼠取仰臥位固定于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)臺(tái)，游離頸部正中，分離氣管、左側(cè)頸動(dòng)脈、右側(cè)頸外靜脈，氣管切開(kāi)插自制氣管插管，全身肝素化，24G 帶側(cè)孔套管針穿刺右側(cè)靜脈并送入右心房作為靜脈引流，24G 套管針穿刺入左側(cè)頸動(dòng)脈作為動(dòng)脈灌注。游離左側(cè)股動(dòng)、靜脈，分別置入持續(xù)動(dòng)脈檢測(cè)針與微量注射泵。全血凝固時(shí)間超過(guò)480s 后開(kāi)始轉(zhuǎn)流，并逐步降溫至32℃，灌注流量逐步增加至80～100ml·kg-1·min-1，動(dòng)脈壓維持在60～80mmHg。血流檢測(cè)穩(wěn)定后，于左側(cè)第4 肋間進(jìn)胸分離阻斷左側(cè)肺門(mén)60min。開(kāi)放后行循環(huán)15～20min，并復(fù)溫至37℃后停止體外循環(huán)。停機(jī)前經(jīng)頸動(dòng)脈插管應(yīng)用魚(yú)精蛋白中和肝素，拔除CPB管道，經(jīng)尾靜脈回輸機(jī)血。PHC 組于體外循環(huán)轉(zhuǎn)流前30min 泵入PHC 2ml/kg，Control 組與CPB 組泵入等量生理鹽水。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)分別在體外循環(huán)前30min（T0）、體外循環(huán)術(shù)后1h（T1）、4h（T2）、8h（T3）時(shí)間點(diǎn)抽取血樣3ml 行血?dú)夥治觯?jì)算氧合指數(shù)（OI）和呼吸指數(shù)（RI）；嚴(yán)格按ELISA 試劑盒要求檢測(cè)血液中SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平；于T3 時(shí)間點(diǎn)取血后處死大鼠，取部分肺組織用免疫組化染色法檢測(cè)SP-B、SP-C 蛋白表達(dá)。將左肺組織于10%磷酸福爾馬林固定，不同濃度酒精洗滌、脫水、石蠟包埋，切4μm 的蠟帶，45℃溫箱烤片12h 后二甲苯脫蠟水化，加入檸檬酸緩沖液抗原修復(fù)，加入3%H2O237℃孵育10min，阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，10%山羊血清37℃封閉孵育20min，滴加SP-B、SP-C 一抗，37℃孵育6h 后PBS 沖洗3 次，開(kāi)始滴加辣根標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗孵育20min 后PBS 沖洗3 次，滴加二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）顯色液并于顯微鏡下觀(guān)察，顯色滿(mǎn)意后終止染色。顯微鏡下高倍鏡（×400）視野拍照，細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)呈棕黃、褐色反應(yīng)代表抗原的定位，用Image-Pro Plus7.0 圖像分析軟件對(duì)照片進(jìn)行測(cè)量分析。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 25.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多樣本均數(shù)間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用LSD-t 法，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠OI 和RI 比較與Control 組相比，CPB 組、PHC 組大鼠在T1～T3 時(shí)間點(diǎn)OI 均下降，RI 均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。PHC 組大鼠在T1～T3 時(shí)間點(diǎn)OI 均高于CPB 組，RI 低于CPB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比較與Control 組相比，CPB 組、PHC 組大鼠在T1～T3時(shí)間點(diǎn)SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 均上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與CPB 組相比，PHC 組大鼠在T1～T3 時(shí)間點(diǎn)IL-6 降低，IL-10 升高，在T2、T3 時(shí)間點(diǎn)SP-A、SP-D 均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠肺組織SP-B、SP-C 表達(dá)水平比較與Control 組相比，CPB 組、PHC 組大鼠SP-B、SP-C蛋白在胞漿中表達(dá)不連續(xù)，陽(yáng)性表達(dá)較Control 組明顯下降，SP-B、SP-C 蛋白的平均光密度值較Control組減少。與CPB 組相比，PHC 組大鼠SP-B、SP-C蛋白在胞漿中表達(dá)連續(xù)性增加，陽(yáng)性表達(dá)增多，SP-B、SP-C 蛋白的平均光密度值較CPB 組增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表3。

表1 各組大鼠OI、RI 比較（±s，n=10）

表1 各組大鼠OI、RI 比較（±s，n=10）

注：與Control 組相比，*P＜0.05；與CPB 組相比，ΔP＜0.05

指標(biāo) 組別 T0 T1 T2 T3 OI Control 組 446.4±18.7 412.9±19.3 428.4±19.5 432.5±18.9 CPB 組 446.5±20.2 313.4±16.8* 284.2±18.6* 215.8±15.5*PHC 組 447.2±21.1 383.3±18.3*Δ 312.7±21.5*Δ 237.6±16.3*Δ RI Control 組 0.424±0.052 0.512±0.054 0.546±0.043 0.499±0.037 CPB 組 0.425±0.052 2.116±0.072* 2.785±0.034* 2.458±0.033*PHC 組 0.427±0.043 1.811±0.063*Δ 2.415±0.074*Δ 2.053±0.054*Δ

表2 各組大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比較（±s，pg/ml）

表2 各組大鼠SP-A、SP-D、IL-6、IL-10 水平比較（±s，pg/ml）

注：與Control 組相比，*P＜0.05；與CPB 組相比，ΔP＜0.05

指標(biāo) 組別 T0 T1 T2 T3 SP-A Control 組 9.80±0.71 10.20±0.71 11.30±0.71 10.80±0.71 CPB 組 9.88±0.67 44.18±6.37* 107.81±11.38* 92.81±12.77*PHC 組 9.71±0.74 Control 組 14.20±0.88 CPB 組 13.98±0.87 42.29±6.87* 70.28±8.54*Δ 61.63±9.57*Δ SP-D 15.50±0.88 16.20±0.97 15.20±0.98 64.66±7.37* 184.34±9.54* 147.13±13.78*PHC 組 14.11±0.90 62.87±8.49* 168.52±10.63*Δ 135.48±14.55*Δ IL-6 Control 組 44.90±5.41 65.89±5.32 70.91±6.66 55.10±6.81 CPB 組 43.88±5.37 126.92±7.55* 210.87±8.79* 141.29±6.57*PHC 組 45.11±5.87 97.38±6.56*Δ 177.62±7.39*Δ 121.33±6.48*Δ IL-10 Control 組 66.13±5.33 93.68±7.54 121.77±8.44 113.65±8.87 CPB 組 66.25±5.02 110.59±7.66* 141.69±10.17* 133.72±9.17*PHC 組 67.82±5.64 173.85±7.10*Δ 206.54±12.92*Δ 157.56±11.28*Δ

表3 各組大鼠肺組織SP-B、SP-C 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

表3 各組大鼠肺組織SP-B、SP-C 表達(dá)水平比較（±s，n=10）

注：與Control 組相比，*P＜0.05；與CPB 組相比，ΔP＜0.05

組別 SP-B SP-C Control 組 1.45±0.12 1.53±0.11 CPB 組 0.89±0.08* 0.95±0.08*PHC 組 1.02±0.09*Δ 1.18±0.10*Δ

3 討論

體外循環(huán)過(guò)程中人為改變心肺灌注方式導(dǎo)致血液成分、血流動(dòng)力學(xué)的劇烈改變，誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)，而肺組織是對(duì)應(yīng)激反應(yīng)最敏感的器官之一[4]。 體外循環(huán)術(shù)后肺泡上皮細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞破壞導(dǎo)致肺毛細(xì)血管通透性增加、細(xì)胞內(nèi)外液分布失衡、肺組織水腫，造成通氣功能障礙[5]。因此心內(nèi)直視手術(shù)后的肺組織保護(hù)措施成為目前的研究焦點(diǎn)。

RI 和OI 能消除FiO2的影響并且早于PA-aO2反映肺內(nèi)氣體交換和氧合狀態(tài)，是反映急性肺損傷嚴(yán)重程度的敏感和可靠指標(biāo)[6]。IL-6 是白細(xì)胞介素家族中反映組織早期損傷的關(guān)鍵指標(biāo)，是引起放大聯(lián)級(jí)反應(yīng)的中繼因子，為介導(dǎo)炎性因子瀑布樣釋放的始動(dòng)因素。IL-10 是抑制抗原細(xì)胞提呈和炎性因子釋放的對(duì)抗性因子，是組織損傷的保護(hù)性因子，是機(jī)體對(duì)炎性反應(yīng)的免疫抑制和抗炎的效應(yīng) 因子[7]。

肺表面活性物質(zhì)由80%的卵磷脂質(zhì)和8%～ 10%的肺泡表面活性蛋白（SP）組成。SP 共分為4 種蛋白，其中包括SP-A、SP-D 親水性蛋白和SP-B、SP-C疏水性蛋白[1]。本研究結(jié)果顯示，CPB 組IL-6、 IL-10 于T1 時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始升高，T2 時(shí)間點(diǎn)達(dá)到峰值，T3 時(shí)間點(diǎn)緩慢回落，而SP-A、SP-D 則在T2 時(shí)間點(diǎn)開(kāi)始升高并達(dá)到釋放頂峰，T3 時(shí)間點(diǎn)緩慢回落。SP-A、SP-D 正常狀態(tài)下多存在于肺泡上皮細(xì)胞內(nèi)，血液中含量非常少，當(dāng)肺泡上皮細(xì)胞破壞，SP 代謝失衡，SP-A、SP-D 釋放入血引起血漿SP-A、SP-D濃度升高。研究發(fā)現(xiàn)SP 在外周血中增多是因?yàn)榉闻荼砻嫔掀ぜ?xì)胞受損引起血管通透性增高，誘發(fā)SP-A、SP-D 透過(guò)受損的血?dú)馄琳线M(jìn)入血液[8]。蔣光輝等[9]發(fā)現(xiàn)SP-D 親水性更強(qiáng)，血漿濃度更高，是Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞通透性增高的標(biāo)志物。SP-B、SP-C 是肺泡血?dú)馄琳系闹蔚鞍祝饕植加诜闻荼砻妫纬墒杷牧字?蛋白質(zhì)層，維持肺泡表面張力，實(shí)現(xiàn)呼吸的通氣、換氣功能。研究發(fā)現(xiàn)[10，11]，帶有SP-B、SP-C 基因缺陷的小鼠出生后很快就因呼吸衰竭死亡，表明SP-B、SP-C 是SP 所有蛋白中維持正常呼吸功能起著關(guān)鍵作用的支撐蛋白。

鹽酸戊乙奎醚是我國(guó)自主研發(fā)的抗膽堿能受體阻滯藥。現(xiàn)有研究表明，PHC 在膿毒血癥誘發(fā)的急性肺損傷中能夠通過(guò)多種分子通道發(fā)揮抑制白細(xì)胞介素釋放、穩(wěn)定細(xì)胞膜、改善毛細(xì)血管通透性、減輕肺組織損傷的作用[12，13]。但關(guān)于其對(duì)肺泡表面活性蛋白的影響目前研究較少，本研究通過(guò)對(duì)比各組SP-A、SP-D 在外周血中水平發(fā)現(xiàn)，PHC 能顯著抑制大鼠肺組織SP-A、SP-D 釋放入血，免疫組化染色結(jié)果顯示，PHC 能夠穩(wěn)定SP-B、SP-C 蛋白的狀態(tài)與活性，維持肺泡上皮細(xì)胞表面磷脂-蛋白質(zhì)層的完整性，改善大鼠肺泡表面活性因子的代謝。

綜上所述，PHC 預(yù)處理能夠通過(guò)抑制炎性因子釋放減輕肺損傷，其機(jī)制與抑制肺泡表面活性蛋白A、D 轉(zhuǎn)移入血，保護(hù)肺泡表面活性蛋白B、C 活性，維持肺泡結(jié)構(gòu)及改善肺泡張力有關(guān)。