抑制SCD1 對(duì)被動(dòng)吸煙小鼠肺部炎癥的影響

嚴(yán)夢(mèng)楠 張 鴿 周 建 彭文珺 常美佳 李華茵

（復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院呼吸內(nèi)科 上海 200032）

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD）是以不可逆的氣流受限為特征的復(fù)雜、異質(zhì)性疾病［1-2］。吸煙是COPD 發(fā)病的重要因素之一［2］。COPD 患者肺部持續(xù)存在的炎癥會(huì)導(dǎo)致氣道結(jié)構(gòu)的破壞、重塑以及肺氣腫的發(fā)生，從而加重疾病嚴(yán)重程度［3-4］。目前慢性炎癥的機(jī)制尚不清楚，COPD 患者缺少有效的針對(duì)性抗炎治療。 硬脂酰輔酶A 去飽和酶1（stearoyl-CoA desaturases，SCD1）主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上，是催化體內(nèi)諸如硬脂酸、棕櫚酸等飽和脂肪酸（saturated fatty acids，SFA）生成油酸、棕櫚油酸等單不飽和脂肪酸（monounsaturated fatty acids，MUFA）的關(guān)鍵酶［5-6］。飽和脂肪酸能與細(xì)胞表面的免疫受體結(jié)合，激活下游信號(hào)，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生，因此SCD1 在調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中起到一定作用［5］。有關(guān)SCD1在COPD 中的作用目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究中，我們通過(guò)建立被動(dòng)吸煙小鼠模型，觀察并探討SCD1在吸煙小鼠肺部炎癥損傷中的作用。

材料和方法

主要試劑與儀器SCD1 抑制劑CAY10566（美國(guó)MedChemExpress 公 司），用DMSO 制 備 成50 mmol/L 儲(chǔ)存液，分裝保存于-20 ℃，每次使用前用PBS 稀釋至工作濃度。Avertin（美國(guó)Sigma 公司）；BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限 公 司）；SCD1 抗 體（ 美 國(guó) Cell Signaling Technology 公司）；RIPA 裂解液、PMSF、ECL 化學(xué)放光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；鼠TNF-α、IL-6、IL-1β ELISA 試 劑 盒（美 國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司）；電化學(xué)發(fā)光法試劑盒（美國(guó)Meso Scale Discovery 公司）；超敏多因子電化學(xué)發(fā)光分析儀（美國(guó)Meso Scale Discovery 公司，型號(hào)QuickPlex SQ120）；大前門(mén)香煙（焦油量10 mg，煙堿量0.8 mg，CO 量12 mg）；自制透明有機(jī)玻璃染毒箱（30 cm×30 cm×45 cm）。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物6～8 周健康雄性C57BL/6 小鼠購(gòu)自上海南方模式公司，由復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心統(tǒng)一飼養(yǎng)。小鼠可自由飲水進(jìn)食，溫度保持在22～26 ℃，保證12 h/12 h 的晝夜明暗交替。

動(dòng)物造模小鼠隨機(jī)分為4 組，分別為對(duì)照（CON）組、SCD1 抑 制 劑 給 藥 組（CAY）、吸 煙（Smoke）組以及吸煙同時(shí)給予SCD1 抑制劑（Smoke+CAY）組，每組11～14 只。CON 組不作任何處理；CAY 組每日定時(shí)以5 mg/kg 劑量腹腔注射SCD1 抑制劑CAY10566；Smoke 組小鼠每日給予香煙煙熏約2 h，具體方法為每次點(diǎn)燃1 支香煙插入自制染毒箱內(nèi)，5～6 min 后點(diǎn)燃第2 支，如此往復(fù)，直至吸完20 支香煙；Smoke+CAY 組小鼠每日在煙熏基礎(chǔ)上，定時(shí)給予5 mg/kg 劑量腹腔注射CAY10566。造模共持續(xù)30 天，每隔10 天記錄小鼠體重變化，最后一次煙熏結(jié)束24 h 后取材。

動(dòng)物取材動(dòng)物稱重，按體重以20 mg/mL 劑量腹腔注射Avertin 麻醉，摘取眼球放血，分離獲得血漿，保存于-20 ℃。暴露氣管與胸腔，結(jié)扎右肺，用0.5 mL 冰PBS 對(duì)左肺進(jìn)行單肺灌洗，重復(fù)抽吸3 次，獲得肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）。取一葉肺用甲醛固定，石蠟包埋，進(jìn)行HE染色，顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變，分析肺泡平均內(nèi)襯間隔（mean linear intercept，MLI）；其余肺組織保存于-80 ℃冰箱。取肝臟組織并進(jìn)行稱重，按照公式“肝臟重量/體重×100%”計(jì)算得到肝臟系數(shù)［7］。

肺泡灌洗液中蛋白濃度及細(xì)胞計(jì)數(shù)測(cè)定新鮮獲得的肺泡灌洗液經(jīng)300×g離心5 min，分離上清至新離心管，利用BCA 法測(cè)定肺泡灌洗液中的蛋白濃度，細(xì)胞沉淀用PBS 重懸后計(jì)數(shù)。

細(xì)胞因子測(cè)定按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)小鼠肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6、IL-1β 的含量進(jìn)行檢測(cè)。利用MSD 檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)血漿中IL-4、IL-10、IL-13 表達(dá)情況。

RT-qPCR取適量肺組織，利用Trizol 法提取組織中的總RNA，測(cè)定濃度后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，用SYBR-Green I Real-Time PCR Kit 進(jìn) 行PCR 反 應(yīng)。β-actin 上 游 引 物：5‘-CTACCTCATGAAGATCCTGACC-3’，β-actin 下游引物：5‘-CACAGCTTCTCTTTGATGTCAC-3’；SCD1上游引物：5’-AACATTCAATCCCGGGAGAATA-3’，SCD1 下游引物：5’-GAAACTTTCTTCCGGTCGTAAG-3’。

Western blot用RIPA 加PMSF 裂解組織蛋白后，采用BCA 法測(cè)定組織蛋白濃度。將蛋白樣本加入上樣孔進(jìn)行電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉后，選擇對(duì)應(yīng)一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后室溫下二抗孵育1 h，然后加入ECL 化學(xué)發(fā)光液對(duì)條帶進(jìn)行曝光。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法利用Graphpad Prism6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，結(jié)果用x±s表示，兩獨(dú)立樣本比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較先采用單因素方差分析，再采用Bonferroni 法進(jìn)行兩兩比較。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

吸煙小鼠肺內(nèi)SCD1 表達(dá)水平升高比較CON 組與Smoke 組小鼠肺內(nèi)SCD1 mRNA（圖1A）及蛋白質(zhì)（圖1B）水平，發(fā)現(xiàn)吸煙造模后小鼠肺內(nèi)SCD1 表達(dá)升高。

抑制SCD1 后小鼠體重及肝臟系數(shù)的變化情況每隔7 天對(duì)小鼠體重進(jìn)行稱重，并與第0 天小鼠體重進(jìn)行比較，得到體重變化率。CON 組及Smoke 組小鼠體重隨天數(shù)增加而增長(zhǎng)，而CAY 組及Smoke+CAY 組小鼠體重呈下降趨勢(shì)，且CAY 組小鼠體重下降趨勢(shì)更為明顯（圖2A）。經(jīng)過(guò)30 天造模后取材，與CON 組相比，取材時(shí)CAY 組及Smoke+CAY 組小鼠的肝臟系數(shù)明顯下降（P＜0.05，圖2B）。由此可見(jiàn)，給予SCD1 抑制劑對(duì)小鼠體重及肝臟系數(shù)的影響效果明顯。

抑制SCD1 加重吸煙小鼠肺部炎癥對(duì)小鼠肺組織切片并行HE 染色，觀察到CON 組（圖3A）及CAY 組（圖3B）肺泡壁變薄，結(jié)構(gòu)清晰、完整，氣道周圍極少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。Smoke 組（圖3C）及Smoke+CAY 組（圖3D）小鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡間隔明顯增厚，支氣管纖毛結(jié)構(gòu)破壞，氣道周圍炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，且Smoke+CAY 組肺泡腔破壞、擴(kuò)大、融合更為明顯。病理分析顯示吸煙造模組肺泡MLI高于不吸煙組，并且給予SCD1 抑制劑的Smoke+CAY 組MLI 明顯高于Smoke 組。

抑制SCD1 后小鼠BALF 蛋白濃度及細(xì)胞計(jì)數(shù)變化測(cè)定蛋白濃度后發(fā)現(xiàn)，Smoke+CAY 組肺泡灌洗液中的蛋白濃度較其余組升高（圖4A）。對(duì)BALF 中的細(xì)胞進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，Smoke+CAY 組的細(xì)胞計(jì)數(shù)最高，且與CON 組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，圖4B）。

抑制SCD1 后小鼠細(xì)胞因子變化檢測(cè)小鼠BALF 中TNF-α（圖5A）、IL-6（圖5B）、IL-1β（圖5C）水平發(fā)現(xiàn)，吸煙小鼠肺內(nèi)TNF-α、IL-6、IL-1β 水平均較未吸煙組升高，并且Smoke+CAY 組小鼠IL-6 水平較Smoke 組明顯升高，提示Smoke+CAY 組小鼠肺內(nèi)炎癥水平更高。比較血漿中IL-4、IL-10、IL-13水平，IL-4 在CAY 組及Smoke+CAY 組升高，而在Smoke 組降低，但總體表達(dá)水平低，且差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；IL-10 及IL-13 水平在各組中差異不大。

討 論

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)被動(dòng)吸煙小鼠較正常對(duì)照小鼠肺內(nèi)SCD1 水平升高。為進(jìn)一步研究SCD1水平升高在被動(dòng)吸煙小鼠中起保護(hù)性作用還是損傷性作用，我們建立了被動(dòng)吸煙加腹腔注射SCD1抑制劑的小鼠模型，比較病理及相關(guān)炎癥指標(biāo)。結(jié)果顯示，Smoke+CAY 組小鼠肺部損傷程度加重，炎癥水平更高。

既往研究發(fā)現(xiàn)，敲除野生型小鼠SCD1 基因后，小鼠能量消耗及脂肪酸氧化增加，體內(nèi)脂肪沉積減少，能有效避免高脂或高碳水化合物飲食帶來(lái)的體重增長(zhǎng)，且對(duì)胰島素具有更高的敏感性［8-9］。本研究中，腹腔注射SCD1 抑制劑的C57BL/6 小鼠體重減輕，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。

肺內(nèi)細(xì)胞種類多且環(huán)境復(fù)雜，因此COPD 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。COPD 的肺部表現(xiàn)有慢性炎癥、氣道重塑以及肺氣腫改變［1］。COPD 疾病進(jìn)展及病死率與患者體內(nèi)炎癥水平相關(guān)［10-11］。多種細(xì)胞因子參與COPD 的炎癥反應(yīng)。在COPD 患者痰中，TNF-α 和IL-6 等濃度升高，且COPD 急性加重時(shí)，濃度更高［12］。我們通過(guò)檢測(cè)吸煙小鼠BALF 中相應(yīng)炎癥細(xì)胞因子來(lái)判斷小鼠肺部炎癥水平，發(fā)現(xiàn)Smoke+CAY 組小鼠肺內(nèi)炎癥水平顯著升高。IL-10 是一個(gè)抗炎因子，研究發(fā)現(xiàn)IL-10 在COPD 患者血清中表達(dá)減少［13-14］，而在本研究中IL-10 改變不明顯。IL-4和IL-13 在介導(dǎo)變態(tài)反應(yīng)性炎癥中發(fā)揮一定作用，在哮喘患者中二者水平升高［12］。臨床上部分COPD患者會(huì)同時(shí)表現(xiàn)出COPD 和哮喘的癥狀［15］。我們檢測(cè)了各組小鼠血漿中IL-4 和IL-13 水平，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前COPD 的治療主要是減輕咳嗽、呼吸困難等臨床癥狀，而缺乏促進(jìn)COPD 患者體內(nèi)促炎與抗炎平衡的有效治療，這促使我們繼續(xù)深入研究COPD 的炎癥機(jī)制。

肥胖被認(rèn)為是心血管疾病、代謝性疾病等的危險(xiǎn)因素，并且會(huì)增加疾病的病死率。但也有研究發(fā)現(xiàn)，相較于低體重指數(shù)（body mass index，BMI）的COPD 患者，超重及肥胖患者的生存率更高［16］。對(duì)二戰(zhàn)華沙猶太區(qū)中因饑餓死去的人們進(jìn)行尸檢時(shí)發(fā)現(xiàn)很多人有肺氣腫。嚴(yán)格控制大鼠的卡路里攝入，幾周后大鼠肺部呈現(xiàn)肺氣腫樣改變［17］。這些則提示肺氣腫的改變可能與脂質(zhì)代謝的變化有關(guān)，脂質(zhì)代謝在COPD 的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色。

SCD1 在調(diào)節(jié)體內(nèi)脂質(zhì)代謝平衡中發(fā)揮重要作用。既往SCD1 在腫瘤中的研究較多。在肝癌、腎癌、肺癌、結(jié)直腸癌組織中，SCD1 表達(dá)升高，起到維持腫瘤細(xì)胞增殖、減少凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞分化與惡變中的作用［18-19］。SCD1 可以催化體內(nèi)SFA 生成MUFA，MUFA 進(jìn)而作為底物被用來(lái)合成三酰甘油、膽固醇酯及磷脂等［6］。因此，抑制體內(nèi)SCD1 會(huì)導(dǎo)致SFA 比例相對(duì)增加，而MUFA 比例相對(duì)減少。降低健康年輕人飲食中SFA/MUFA 比例，可以減少外周血單個(gè)核細(xì)胞IL-1β、IL-18、IL-10 和TNF-α的分泌以及循環(huán)中TNF-α 的水平［20］。在非酒精性肝病的研究中發(fā)現(xiàn)，SFA 會(huì)引起肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激水平升高及肝細(xì)胞凋亡增加［21］。研究發(fā)現(xiàn)SFA 與LPS 類似，可通過(guò)TLR4 激活炎癥信號(hào)通路，促進(jìn)NF-κB 和COX2 的表達(dá)［22］。故SFA 與MUFA 的比例變化會(huì)影響體內(nèi)炎癥水平。脂肪生成轉(zhuǎn)錄因子固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋 白-1c 及 核 受 體LXR 可 以 誘 導(dǎo)SCD1 的 表 達(dá)［23］。吸煙者及COPD 患者肺組織中LXR 水平升高，且對(duì)COPD 患者的肺泡巨噬細(xì)胞具有一定的抗炎作用［24］。這些均引發(fā)了人們研究SCD1 在COPD 中作用的興趣。

本研究發(fā)現(xiàn)，被動(dòng)吸煙小鼠肺內(nèi)SCD1 水平升高，抑制SCD1 表達(dá)會(huì)加重吸煙小鼠肺部結(jié)構(gòu)破壞，且相較單純吸煙小鼠炎癥水平更高，提示吸煙后肺內(nèi)SCD1 升高可能起到保護(hù)性抗炎作用。未來(lái)可進(jìn)一步對(duì)SFA 及MUFA 水平進(jìn)行檢測(cè)，從而驗(yàn)證抑制SCD1 加重炎癥反應(yīng)是否與脂質(zhì)代謝改變有關(guān)。