溶血血小板活化因子乙酰基轉(zhuǎn)移酶（LPAFAT）活性檢測方法的比較

胡傢椿 董繼斌 樓 濱 李英霞 蔣憲成 丁庭波

（1復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院藥理與生化教研室，2合成藥物化學(xué)教研室，3藥學(xué)實驗教學(xué)中心 上海 201203）

血小板活化因子（platelet activating factor，PAF）是一種強效的磷脂類炎癥介質(zhì)，化學(xué)結(jié)構(gòu)為1-O-烷基-2-乙酰基-Sn-甘油-3-磷酸膽堿。內(nèi)皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等多種細(xì)胞可合成PAF并釋放入血液。PAF 可參與多種生理病理過程，如過敏反應(yīng)，哮喘和動脈粥樣硬化等。PAF 通過結(jié)合細(xì)胞膜上的PAF 受體（PAF receptor，PAFR）發(fā)揮生物學(xué)活性，PAFR 是一種G 蛋白偶聯(lián)受體［1-3］。血漿中的PAF 可被PAF 乙酰基水解酶催化為溶血血小板活化因子（Lyso-PAF），從而失去PAF 的生物學(xué)活性［4-5］。細(xì)胞內(nèi)PAF 的生成有兩種途徑，一種是從頭合成途徑，該途徑合成的PAF 參與維持細(xì)胞的正常生理功能；另一種生成PAF 的途徑為磷脂重構(gòu)（即Lands’cycle）：在炎癥刺激下，細(xì)胞膜的PAF 被iPLA2（細(xì)胞內(nèi)鈣離子非依賴性磷脂酶A2）水解，去除Sn-2 位脂酰基，生成Lyso-PAF，然后在Lyso-PAF 乙酰基轉(zhuǎn)移酶（Lyso-PAF acetyl transferase，LPAFAT）催化下，Lyso-PAF 的Sn-2 位羥基乙酰化而生成PAF。LPAFAT 的底物為Lyso-PAF 和乙酰CoA，其產(chǎn)物為PAF 和CoA-SH［5-6］（圖1）。

血漿中的PAF 濃度雖然只有pmol/L 級，但造成的炎癥效應(yīng)強大，參與了多種病理過程，抑制PAF 引起的炎癥效應(yīng)是當(dāng)前的研究熱點之一。已有文獻以PAFR 為靶標(biāo)，研究開發(fā)PAFR 的拮抗劑，并已有藥物應(yīng)用于臨床，而新的PAFR 拮抗劑還在陸續(xù)開發(fā)［7］。在此類藥物開發(fā)過程中，Deng等［8］發(fā)現(xiàn)了一種不依賴PAFR 的PAF 病理效應(yīng)，單獨拮抗PAFR 并不能達(dá)到理想的藥理學(xué)作用，因此如何減少血漿中炎癥性PAF 的濃度成為接下來的重要研究方向。研究表明血漿中的一些多肽或其衍生物可以結(jié)合PAF 本身，從而降低PAF 的致炎效應(yīng)，進而削弱PAF 的藥理學(xué)作用［9-10］。另一種減少PAF 炎癥效應(yīng)的方法是開發(fā)LPAFAT 抑制劑，以減少體內(nèi)PAF 的生物合成。目前LPAFAT 抑制劑的開發(fā)已經(jīng)取得較大進展，文獻報道至少有4 種母核具有LPAFAT 的抑制活性［11-13］。

在開發(fā)LPAFAT 抑制劑的過程中，我們采用了多種LPAFAT 活性的檢測方法，并用這些方法篩選化合物的抑制活性。本文采用一個陽性抑制劑TSI-01［12］和一個假陽性抑制劑硝酸咪康唑為例，評價常用的LPAFAT 活性測定方法在抑制劑篩選中的優(yōu)缺點。

材料和方法

實驗材料硝酸咪康唑（M3512），化合物TSI-01 由復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院合成藥物化學(xué)教研室合成并鑒定，Lyso-PAF（L5016），乙酰CoA（A2056），還原性CoA-SH（C4780），PAF 標(biāo)準(zhǔn)品（P4904），CPM［7-Diethylamino-3- （4-maleimidophenyl） -4-methylcoumarin］（C1484）（美 國Sigma-Aldrich 公司），NBD-Lyso PC（Avanti Polar lipids，810128P），HPTLC 硅膠板（煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司，型號HSG），其他常規(guī)試劑均為國藥集團分析純產(chǎn)品。

LC/MS/MS 檢測PAF 含量本文利用天然底物L(fēng)yso-PAF 和乙酰CoA 建立酶促反應(yīng)，在高效液相色譜和二級質(zhì)譜的分離和檢測下，直接測定產(chǎn)物PAF 的含量。方法參考文獻［12，14］并略有修改。

腎微粒體的分離 低溫超速離心法分離腎微粒 體（LPAFAT 來 源）為 常 規(guī) 方 法［10］。冰浴下C57BL/6小鼠腎臟在20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、300 mmol/L 蔗糖緩沖液中充分勻漿，勻漿液于4 ℃9 000×g離心10 min，取上清在4 ℃100 000×g離 心1 h，沉 淀 用100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2、0.007 5% Tween-20 緩沖液懸浮，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

體外酶促反應(yīng)的建立 含100 μg 蛋白的腎微粒 體 懸 浮 于100 μL 含100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20 緩沖液中，在冰浴中加入濃度為0.5 mg/mL 的Lyso-PAF 6 μL（溶劑為1∶1 的二甲亞砜∶甲醇，v/v）和濃度為2 mg/mL 的乙酰CoA 水溶液6 μL。加入溶解于二甲亞砜的TSI-01（儲備液濃度10 mmol/L）/硝酸咪康唑（儲備液濃度10 mmol/L）或加入等量二甲亞砜作為對照，使TSI-01 或硝酸咪康唑在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0、10、30、100 μmol/L，上述體系混勻后放置于37 ℃水浴10 min。

脂類的提取 在上述反應(yīng)體系中加入300 μL的氯仿∶甲醇（2∶1，v/v）萃取溶劑。劇烈震蕩30 s 后9 000×g離心10 min。各組吸取等量下層有機相轉(zhuǎn)移入新的試管，用氮吹儀將有機相吹干。樣品保存于-80 ℃?zhèn)溆谩AF 標(biāo)準(zhǔn)品用氯仿溶解，配制成不同濃度，各取50 μL 用氮吹儀吹干待用。

LC/MS/MS 檢測 樣品或不同含量的PAF 標(biāo)準(zhǔn)品用50 μL 的異丙醇∶乙腈（1∶1，v/v）復(fù)溶進樣。分析采用HPLC Eksigent LC100 偶聯(lián)AB SCIEX Triple TOF 5600+質(zhì)譜。HPLC 色譜柱：Waters XBridge Peptide BEH C18，3.5 μm，2.1×100 mmol/L，預(yù) 柱：Phenomenex C18，4×20 mmol/L，柱 溫：50 ℃，進樣室溫度：4 ℃，流速：0.4 mL/min，進樣體積：2 μL，流動相A：10 mmol/L 乙酸銨+0.1%甲酸+99.9% 水，流 動 相B：10 mmol/L 乙 酸 銨+0.1% 甲酸+49.95%乙腈+49.95%異丙醇，流動相A 和B 的比例隨時間梯度變化。質(zhì)譜采用負(fù)離子模式。

數(shù)據(jù)處理 參照PAF 標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)據(jù)，用PeakView 1.2軟件將樣品中的PAF 定性，用MultiQuant 2.1 對定性的PAF 定量。

巰基反應(yīng)探針偶聯(lián)分光光度法檢測產(chǎn)物CoA-SH 含量分析法利用天然底物L(fēng)yso PAF 和乙酰CoA 建立酶促反應(yīng)，用巰基反應(yīng)探針CPM 與產(chǎn)物CoA-SH 的巰基反應(yīng)產(chǎn)生熒光信號，通過熒光信號的強弱判斷酶活性大小。本方法在文獻［12］基礎(chǔ)上略有改進。

體外酶促反應(yīng)的建立 參考“LC/MS/MS 檢測PAF 含量法”中的第二步。

產(chǎn)物信號檢測 在反應(yīng)體系中加入100 μL 甲醇，劇 烈 震 蕩30 s 后9 000×g離 心10 min。將50 μL 上清轉(zhuǎn)移入96 孔熒光酶標(biāo)板，每孔樣品中加入50 μL 含5 μmol/L CPM（CPM 溶解于甲醇配制成0.5 mg/mL 母液，約為1.242 mmol/L）的50%甲醇水溶液。震搖96 孔板混勻，室溫靜置2 h 后用BioTek Flx800酶標(biāo)儀檢測熒光信號，激發(fā)光350 nm，發(fā)射光450 nm，數(shù)據(jù)采用底讀方式，靈敏度設(shè)置為50。

化合物與CoA-SH 反應(yīng)的檢測 96 孔熒光酶標(biāo)板各孔中加入50 μL 含有還原性CoA-SH（終濃度為20 μg/mL）的緩沖溶液A，然后加入各種不同濃度的硝酸咪康唑或化合物TSI-01，混勻后室溫孵育30 min，隨 后 各 孔 加 入50 μL 含5 μmol/L CPM 的50%甲醇水溶液。后續(xù)操作和數(shù)據(jù)檢測參考“產(chǎn)物信號檢測”。

TLC 檢測熒光標(biāo)記產(chǎn)物分析法以熒光標(biāo)記的Lyso-PAF（或Lyso-PC，圖1A）和乙酰CoA 作為底物建立酶促反應(yīng)，產(chǎn)物為熒光標(biāo)記的PAF 或類似物，通過產(chǎn)物的熒光信號強弱判斷酶活性大小。方法參考文獻［15-16］略有修改。

體外酶促反應(yīng)的建立 含100 μg 蛋白的腎微粒體懸浮于100 μL 100 mmol/L Tris-HCl（pH 7.4）、1 mmol/L CaCl2及0.007 5% Tween-20 緩 沖 液 中，在冰浴中加入濃度為0.5 mg/mL 的NBD-Lyso PC 4 μL 和濃 度 為2 mg/mL 的 乙 酰CoA 水溶 液6 μL。加入溶解于二甲亞砜的TSI-01（儲備液濃度10 mmol/L）或硝酸咪康唑（儲備液濃度10 mmol/L）或加入等量二甲亞砜作為對照，使TSI-01 或硝酸咪康唑在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0、10、30、100 μmol/L。上述體系混勻后放置于37 ℃水浴10 min。

脂類的提取 參考“LC/MS/MS 檢測PAF 含量”中的第三步。

薄層層析（TLC）分離分析 上述脂類提取物用40 μL 氯仿復(fù)溶，用毛細(xì)玻璃管將樣品裝載于HPTLC 硅膠板，采用氯仿∶甲醇∶水（65∶25∶4，v/v）展開10 min。待有機溶劑揮發(fā)干凈，在紫外燈下激發(fā)熒光并拍照。條帶光密度采用Smart View 軟件分析。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計及作圖 每組至少3 次實驗，數(shù)據(jù)表示為x±s，兩組之間的比較采用t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。所有數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 6.0 軟件作圖。化合物分子結(jié)構(gòu)采用ChemBioDraw Ultra 14.0 軟件繪制。

結(jié) 果

LC/MS/MS 檢 測PAF 含 量 法LC/MS/MS 的響應(yīng)值（峰面積）對應(yīng)PAF 含量（pmol/L）的關(guān)系見圖2A，PAF 在0～50 pmol/L 范圍內(nèi)，LC/MS/MS的響應(yīng)值呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系（回歸系數(shù)r＞0.99）。1 pmol/L 范圍以內(nèi)的PAF 與LC/MS/MS 響應(yīng)值之間的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2B。根據(jù)本文建立的酶促反應(yīng)，用LC/MS/MS 檢測所獲得的PAF 峰面積均在100 000 自由單位以內(nèi)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算所得PAF 產(chǎn)物均在2 pmol/L 以內(nèi)。我們通過增減底物種類及使用不同濃度的抑制劑建立酶促反應(yīng)，產(chǎn)物PAF 的含量隨各種因素變化的關(guān)系見圖2C。結(jié)果表明，TSI-01 對LPAFAT 活性有抑制作用，在100 μmol/L 濃度范圍內(nèi)，其抑制作用呈劑量依賴性。硝酸咪康唑沒有LPAFAT 抑制活性。

巰基反應(yīng)探針偶聯(lián)分光光度法檢測產(chǎn)物CoASH 含量分析法CPM 本身幾乎沒有熒光信號，但CPM 與還原性巰基反應(yīng)后生成的熒光信號很強烈。本研究中，CPM 與還原性巰基的反應(yīng)發(fā)生在熒光酶標(biāo)板中，2 h 內(nèi)室溫下產(chǎn)生的熒光信號強弱隨時間的延長而加強。因孵育時間的長短對檢測信號的強弱影響很大，所以不同批次實驗得到的數(shù)據(jù)沒有可比性。在同一批次下，CPM 本身、腎微粒體、酶促反應(yīng)底物L(fēng)yso-PAF 與乙酰輔酶A 對熒光信號的影響見圖3A。該結(jié)果表明，僅有腎微粒體及僅有CPM條件下幾乎沒有熒光信號（圖3A 柱1 和柱2）。不加入底物L(fēng)yso-PAF 和乙酰輔酶A 的條件下，本方法即產(chǎn)生較強的噪音信號（由腎微粒體和CPM 兩種因素同時存在時產(chǎn)生的熒光信號），噪音信號占總信號比例約為39%（圖3A 柱3）。單獨加入底物L(fēng)yso-PAF并不增強熒光信號（圖3A 柱4），但單獨加入底物乙酰輔酶A，熒光信號即達(dá)到峰值（圖3A 柱5），即使加入兩種底物也并未繼續(xù)增加熒光信號（圖3A 柱6）。這種結(jié)果表明，在不加入Lyso-PAF 的條件下，即使單獨加入底物乙酰輔酶A，酶促反應(yīng)中已發(fā)生大量的乙酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)而產(chǎn)生了還原性CoA-SH。蛋白質(zhì)在酶催化或無酶催化下均可發(fā)生乙酰化反應(yīng)。我們用牛血清白蛋白作為乙酰化受體證實了這一現(xiàn)象（圖3B）。由于本方法中蛋白的乙酰化反應(yīng)即已生成大量的還原性CoA-SH（圖3A 柱5），真正由LPAFAT 催化后生成的還原性CoA-SH 與CPM 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號極微弱（圖3A 柱6 與柱5 的差值），因而本方法并不能準(zhǔn)確判斷LPAFAT 活性的大小。但是，我們用本方法檢測TSI-01 和硝酸咪康唑?qū)PAFAT 的抑制作用時，卻得到如圖3C 所示的實驗結(jié)果。該結(jié)果表明TSI-01 呈劑量依賴性地減少由CPM 與還原性CoA-SH 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號。經(jīng)過對TSI-01 結(jié)構(gòu)的分析，我們猜測該化合物可直接與還原性CoA-SH 發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)，從而消耗大量還原性CoA-SH，減少了還原性CoA-SH 與CPM 反應(yīng)生成的熒光信號。為驗證這一假設(shè)，我們用還原性CoA-SH 標(biāo)準(zhǔn)品與TSI-01 反應(yīng)，然后用CPM 檢測剩余還原性CoA-SH 的含量（圖3D），該結(jié)果表明TSI-01 呈劑量依賴性地減少由CPM 與還原性CoA-SH 反應(yīng)產(chǎn)生的熒光信號。

TLC 檢測熒光標(biāo)記產(chǎn)物分析法NBD-Lyso PC 中，熒光基團與Sn-1 位的脂酰基連接，由于細(xì)胞勻漿或微粒體中存在的磷脂酶A1 活性很強，在酶促反應(yīng)中生成了大量副產(chǎn)物NBD 標(biāo)記的游離脂肪酸（圖4 中NBD-FFA 條帶）。盡管如此，以NBDLyso PC 和乙酰CoA 為底物，仍然可以測定LPAFAT 的活性（圖4 中NBD-PAF 類似物條帶）。不同濃度的TSI-01 和硝酸咪康唑?qū)PAFAT 都有抑制作用，且抑制作用呈劑量依賴性（圖4A、4B）。

討 論

動物血漿或細(xì)胞中生理條件下的PAF 含量極其微少，至今已發(fā)展出多種方法監(jiān)測生理條件下的PAF 含量。有學(xué)者將PAF 衍生加入熒光基團后，用高效液相色譜檢測，可檢測低至100 pg 的PAF。但該方法費時，樣品容易損失而引入操作誤差［17］。至今最靈敏的方法是先去除PAF 的磷酸膽堿極性基團，替代為非極性基團，成為揮發(fā)性物質(zhì)，然后用氣相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用檢測，可檢測到低至50 fg 的PAF［14］。但該方法同樣費時，樣品容易損失而引入操作誤差，價格也很高昂。用高效液相色譜和二級質(zhì)譜聯(lián)用直接對PAF 檢測，文獻報道稱可檢測到低至1 pg（1.9 fmol）的PAF［14］。本 文 所 建 立 的LC/MS/MS 方法可檢測到低至0.01 pmol 的PAF，足以用于體外監(jiān)測LPAFAT 的活性。該方法省時，由人為操作引入的誤差小，數(shù)據(jù)重現(xiàn)性高，但檢測成本依然較高。通過LC/MS/MS 方法檢測PAF 的含量來判斷LPAFAT 活性，與本文介紹的其他兩種方法比較，優(yōu)點在于建立酶促反應(yīng)時，所使用的底物均是天然結(jié)構(gòu)，最符合酶與天然底物的結(jié)合狀態(tài)，能準(zhǔn)確判斷LPAFAT 的真實活性及化合物對該酶是否具有真實的抑制作用。本文采用兩種化合物TSI-01 和硝酸咪康唑，TSI-01 對LPAFAT 具有抑制作用，但硝酸咪康唑并沒有LPAFAT 的抑制活性（圖2C）。

LPAFAT 催化反應(yīng)的產(chǎn)物除了PAF，還有CoA-SH。通過檢測CoA-SH 的含量來判斷酶活性大小，具備良好潛力。在本文建立的酶促反應(yīng)中，底物乙酰CoA 發(fā)生了非特異性的轉(zhuǎn)乙酰基反應(yīng)，因而產(chǎn)生了大量的CoA-SH，造成該方法的本底噪音較大（圖3A 柱5 與柱4 的差值）。這種大量的轉(zhuǎn)乙酰基反應(yīng)可能由蛋白的乙酰化造成（圖3B）。巰基反應(yīng)探針CPM 除了與CoA-SH 反應(yīng)產(chǎn)生熒光外，其與蛋白質(zhì)中的還原性-SH 基團反應(yīng)也可產(chǎn)生熒光信號（該數(shù)據(jù)在本文沒有提供）。與Tarui 等［12］采用的方法相比，本文已有改進，我們在酶促反應(yīng)結(jié)束后用甲醇將大量蛋白沉淀，使其與CoA-SH 分離，但上清中仍然殘留少量蛋白質(zhì)（帶有還原性-SH 基團），也是本底噪音信號的來源之一（圖3A 柱3 和柱4，圖3B 柱1）。除了底物乙酰CoA 外，加入另一個底物L(fēng)yso PAF，并沒有使由LPAFAT 催化產(chǎn)生的CoASH 信號大幅提升（圖3A 柱6 與柱5 的差值），所以該方法并不適合于檢測LPAFAT 的催化活性。

與巰基反應(yīng)探針CPM 的官能團一樣，TSI-01的母核也是馬來酰亞胺，與蛋白質(zhì)中的還原性-SH或CoA-SH 中的-SH 都可以發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。當(dāng)TSI-01 在酶促反應(yīng)中存在時，已與蛋白質(zhì)中的-SH 和生成的CoA-SH 中的-SH 發(fā)生了反應(yīng)，消耗了大量-SH 基團，因而在最終加入CPM 檢測CoA-SH含量時，熒光信號對TSI-01 的濃度有劑量依賴性的變化（圖3C）。雖然TSI-01 確實具有LPAFAT 抑制作用（圖2C），但圖3C 中熒光信號的減弱卻并非由于該化合物的LPAFAT 抑制活性所引起。Tarui等［12］在篩選LPCAT2 抑制劑時，從 化 合 物 庫中的174 131 個化合物庫中篩選的第一步，使用的正是這種方法。他們在后續(xù)篩選中采用了LC/MS/MS 方法，但正是由于第一步篩選方法的失誤，造成最終篩選出來的十?dāng)?shù)個化合物雖然具有LPAFAT 活性，其IC50可低至0.13 μmol/L，但這些化合物的母核均是馬來酰亞胺。這批化合物除了與CoA-SH 反應(yīng)外，均可非特異性的與蛋白質(zhì)中的-SH 反應(yīng)，因而不具有成藥性。

熒光信號具有靈敏度高，易于顯影和定量的特點，因而熒光基團標(biāo)記底物用于檢測酶活性或篩選酶 的 抑 制劑也逐步被 廣 泛 采 用［15-16，18-19］。但熒光基團標(biāo)記底物后改變了底物的天然結(jié)構(gòu)，可能造成酶與底物的結(jié)合并不符合天然狀態(tài)。由于市面上沒有熒光標(biāo)記的Lyso PAF 銷售，我們采用易于購買的NBD 標(biāo)記的Lyso PC。Lyso PC 與Lyso PAF 的結(jié)構(gòu)非常相似，兩者的差別僅在于甘油骨架的Sn-1位所連接基團的化學(xué)鍵，Lyso PAF 的Sn-1 位為醚鍵而Lyso PC 的Sn-1 位為酯鍵（圖1A）。以NBDLyso PC 和乙酰CoA 為 底 物，可以測定LPAFAT 的活性（圖4）。采用這種方法可見TSI-01 對LPAFAT具有抑制作用（圖4A），但并無LPAFAT 抑制活性的硝酸咪康唑也可以抑制產(chǎn)物NBD-PAF 類似物的生成，且呈劑量依賴性（圖4B）。用熒光標(biāo)記底物建立酶促反應(yīng)，檢測熒光標(biāo)記產(chǎn)物的分析方法，有可能對酶的催化活性或抑制劑的篩選造成誤判。硝酸咪康唑即是一種假陽性抑制劑。

由于蛋白質(zhì)的乙酰化反應(yīng)可產(chǎn)生大量的CoASH，干擾了對LPAFAT 活性的正確判斷，因此通過產(chǎn)物CoA-SH 的含量測定LPAFAT 活性的方法雖然具備良好潛力，但也存在嚴(yán)重缺陷，仍需進一步優(yōu)化。

用熒光標(biāo)記底物建立酶促反應(yīng)，通過產(chǎn)物NBD-PAF（類似物）的熒光強度可用于LPAFAT活性檢測及抑制劑的篩選。該方法對酶的催化活性或抑制劑的篩選可能有誤判，因此應(yīng)慎重對待實驗結(jié)果。由于成本低，易于操作，在化合物的早期初篩時可采用此辦法。

用天然結(jié)構(gòu)的底物L(fēng)yso-PAF 和乙酰CoA 建立酶促反應(yīng)，通過LC/MS/MS 測定產(chǎn)物PAF 的含量，是判斷LPAFAT 活性或篩選其抑制劑的最佳方法，可作為最終判定的依據(jù)，但價格昂貴。