絲氨酰tRNA 合成酶（SerRS）結合并激活去乙酰化酶SIRT2 的機制

秦懿偲 周德健 李超群 余 巍

（復旦大學生命科學學院微生物系 上海 200438）

賴氨酸乙酰化修飾是一種保守的、可逆的蛋白質翻譯后修飾，參與調控許多細胞信號通路和疾病發病過程。乙酰化修飾通過改變賴氨酸殘基上的電荷導致蛋白質構象變化，進而影響酶活、定位、DNA結合力和蛋白質穩定性［1-2］。蛋白質的賴氨酸乙酰化由賴氨酸乙酰基轉移酶（lysine acetyltransferases，KATs）和賴氨酸去乙酰化酶（lysine deacetylases，KDACs）調 控。Sirtuins 家族是第Ⅲ類KDACs，它們的去乙酰化活性依賴于NAD+（煙酰胺腺嘌呤二核苷酸）。SIRT2 作為Sirtuins 家族的成員之一，參與多種病理生理的發展過程，包括衰老［3］、能量限制［4-5］、細 胞 凋 亡［6］和 炎 癥 反 應［7］等。研 究 顯 示SIRT2 與心血管疾病的發病機制密切相關［8］。

氨酰tRNA 合成酶（aminoacyl tRNA synthetase，AARS）是一個與蛋白質翻譯緊密相關的古老的蛋白質家族，由20 種酶組成。這些酶通過識別對應氨基酸，使其與消耗ATP 的特定tRNA 連接起來，合成氨酰-tRNA，進而為最終蛋白質合成提供底物。且作為管家蛋白質，AARS 在漫長的進化過程中相當保守。近年來研究揭示了AARSs 在調控細胞生理活動時的新功能。例如，酪氨酰tRNA 合成酶可以作為白藜蘆醇的靶點，在應激條件下，由細胞質轉移至細胞核，影響DNA 損傷修復［9-10］；谷氨酰胺tRNA 合成酶可以同凋亡信號調節激酶ASK1 相互作用，進而對細胞凋亡產生影響［11］。在斑馬魚的遺傳學研究中發現，絲氨酰tRNA 合成酶（seryl-tRNA synthetase，SerRS）可以通過調控血管生成中的關鍵調節因子——血管內皮生長因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）的表達，進而在封閉血液循環系統的發育中發揮重要作用［12-14］。

研究表明，SerRS 可與SIRT2 相互作用，招募SIRT2 入核，且SerRS 與SIRT2 的相互 作用會 增強SIRT2 的去乙酰化活性［15］。但是，SerRS 與SIRT2作用的具體機制仍不清楚。本研究驗證了SerRS能夠與SIRT2 相互作用，并且增強其作用于底物α-微管蛋白（α-tubulin）的去乙酰化酶活性。通過對SIRT2 的H187 位 點 的 探 究，檢 測 其 對SIRT2 與SerRS 結合的調控作用，同時通過結構模擬進行分析，為靶向SIRT2 的H187 位點治療心血管疾病提供了新的方向和思路。

材料和方法

材料和試劑HEK293T 細胞來自本實驗室，DMEM 高糖培養基購自美國HyClone 公司，SeryltRNA synthetase、SIRT2 和HA 抗 體 購 自 英 國Abcam 公司，α-微管蛋白及其K40Ac 抗體分別購自美國Invitrogen 公司和美國Proteintech 公司，FLAG和MYC 抗體則分別購于美國Sigma 公司和美國Cell Signaling Technology 公 司，Flag 磁 珠 購 自 德 國Sigma Aldrich 公司。KOD-plus 定點突變試劑盒購自日本東洋紡公司，煙酰胺購自美國Sigma 公司，BL21 感受態菌株購自上海擎科生物技術有限公司，質粒小抽試劑盒購自天根生物科技公司。

細胞轉染HEK293T 細胞轉染主要采用PEI試劑（以10 cm 培養皿為例）。在添加10%胎牛血清的DMEM 培養基中培養HEK293T 細胞，當細胞密度達到60%～70%時，即可進行轉染。將1 mL DMEM 培養基、5 μg 目的質粒及15 μL PEI 試劑依次加入1.5 mL EP 管中，反復吹打混勻，室溫靜置20 min。將EP 管內的混合液加入細胞培養基，搖勻，放入37 ℃恒溫細胞培養箱中培養，6 h 后更換培養基，24～36 h 后回收細胞。

免疫共沉淀以10 cm 培養皿為例，除去細胞培養基，用4 ℃PBS 溶液洗滌3 次，加入預冷的1 mL 裂解液（提前加入蛋白酶抑制劑），將培養皿置于4 ℃水平搖床上，快速裂解20 min。結束后充分吹打，將裂解液收集到1.5 mL EP 管中，4 ℃下12 000×g離心30 min。取上清，轉移到新的EP 管中。取64 μL 上清，加入16 μL 5×SDS 上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min，用作細胞裂解樣品（Input）。剩余上清中 加 入10 μL Flag 磁 珠，4 ℃旋 轉3 h 或 過 夜。4 ℃下2 000×g離心2 min，去上清。加入1 mL 裂解液，混勻，4 ℃下2 000×g離心2 min，重復3 次。加入70 μL 1×SDS 上樣緩沖液，95 ℃加熱15 min，行Western blot 檢測。

Western blot 檢測向電解槽中加入適量電泳緩沖液后上樣，80 V 恒壓跑30 min，電壓調至130 V跑1～1.5 h，樣品前沿跑至最底端即可轉膜，300 mA恒流濕轉60 min。用5% BSA 溶液（M/V）室溫封閉1 h。一抗孵育，4 ℃搖床過夜或室溫搖床1 h。1×TBST 溶液洗膜5 min，重復3 次。加入HRP 標記的抗小鼠或抗兔的二抗，室溫孵育1 h。1×TBST 溶液洗膜3 次，進行顯影記錄。

蛋白質純化將目的片段克隆重組到pET28ahis 載體上，用重組質粒轉化E.coliBL21。挑取成功表達質粒的單菌落到含有3～5 mL LB（含抗生素）的搖菌管中，37 ℃下培養至菌液渾濁，轉移到含有1 L LB（含抗生素）的錐形瓶中進行擴增，37 ℃下培養 至D600為0.6～0.8，加 入 終 濃 度 為1 mmol/L 的IPTG 進行誘導，16 ℃下繼續培養20 h。4 ℃下5 000×g離心20 min，收集沉淀細菌。

用緩沖液［200 mmol/L Tris-HCl（pH=8.0）+500 mmol/L NaCl+25 mmol/L 咪唑］重懸菌液，在4 ℃下使用流動泵將有His 標簽的蛋白掛到提前平衡好的1 mL 鎳柱上，用AKTA 將鎳柱上的蛋白洗脫下來。濃縮分裝，液氮速凍，-80 ℃保存備用。

SIRT2 酶活檢測酶活反應液配方為50 mmol/L Tris-HCl（pH=9.0）、4 mmol/L MgCl2、0.5 mmol/L DTT、1 μmol/L MAL［Boc-Lys（AC）amc］和1 mmol/L NAD+。將純化的野生型SIRT2 與SerRS 按照一定的摩爾濃度比加入上述反應液中，以MAL［Boc-Lys（AC）amc］為底物在37 ℃下進行反應。設置0、1、2、3 h 的反應時間梯度，加入與反應體系體積相同的停止液（含0.05 g/mL 胰蛋白酶）停止反應，并按照指示測量熒光強度（F360/F460）［16］。

結 果

SIRT2 與SerRS 在細胞內的相互作用我們通過免疫共沉淀實驗來驗證SIRT2 與SerRS 在細胞內的相互作用。因為SIRT1 定位于核內，且被證明可以促進血管生成［17］，所以我們同時驗證了SIRT1是否可以在細胞內與SerRS 結合。 首先在pCDNA3.1b（-）載體上構建帶有Flag 標簽的SerRS表達質粒，同時構建帶有HA 標簽的SIRT1、SIRT2重組質 粒，將SIRT1、SIRT2 分別 與SerRS 共轉染至HEK293T 細胞中進行過表達。轉染48 h 后，收集細胞裂解液，使用Flag M2 磁珠進行免疫共沉淀。Western blot 結果顯示，外源Flag-SerRS 和SIRT2-HA 存在明顯的相互作用，但沒有檢測到與SIRT1-HA 的相互作用（圖1A）。通過半內源的方法在細胞內過表達lag-SIRT1 與lag-SIRT2，免疫共沉之后檢測內源的SerRS，結果與之前相同（圖1B）。

有研究報道定位于胞質的TyrRS 在一定條件下可入核與SIRT1 發生結合［18］。我們在293T 細胞中同時過表達外源的SIRT2-HA 和Flag-TyrRS，并沒有發現兩者的相互作用（圖1C）。證明并不是所有細胞質內的SerRS 都能與SIRT2 結合。

SerRS 可增強SIRT2 的去乙酰化酶活性為了驗證SerRS 與SIRT2 的相互作用對SIRT2 酶活性的影響，我們使用MAL［Boc-Lys（AC）amc］作為底物來進行去乙酰化酶活性檢測。MAL 的N-端與C-端分別與熒光基團和淬滅基團偶聯，去乙酰化酶反應前不能發出熒光。一旦SIRT2 進行去乙酰化反應，淬滅基團與MAL 分離，即可發出熒光，去乙酰化酶的活性可通過測量相應的熒光強度來檢測。結果發現，SerRS 能顯著提升SIRT2 依賴NAD+的去乙酰化酶活性，且隨著SerRS 蛋白質濃度的增加，其對SIRT2 酶活的促進作用增強（圖2A）。

α-微管蛋白作為SIRT2 去乙酰化底物之一，其乙酰化程度可調控自身的穩定性，進而對糖尿病性心肌病及相關心力衰竭產生一定的影響［19］。我們將微管蛋白作為反應底物，煙酰胺（nicotinamide，NAM）作為SIRT2 去乙酰化反應抑制劑，在體外按照0、1、2 的SerRS 與SIRT2 摩爾濃度比梯度與細胞裂解液在反應液中混合，經Western blot 驗證，微管蛋白乙酰化水平隨SerRS 濃度增加而不斷降低（圖2B）。因此，SerRS 可增強SIRT2 酶活性，使α-微管蛋白的乙酰化程度降低。

SIRT2 H187 位點可影響與SerRS 的結合為了尋找影響SIRT2 和SerRS 互作的位點，通過檢索文獻并對不同物種的SIRT2 之間的同源性進行比對，我們發現SIRT2 上的H187 位點保守性較高（圖3A）。該位點對SIRT2 本身依賴NAD+的去乙酰化酶活性有關鍵作用［20］。當187 位點組氨酸（H）突變成酪氨酸（Y）時，SIRT2 酶活喪失。我們以另一個影響SIRT2 酶活的S368D 突變為對照，通過外源和半內源的方法，檢測在細胞內SerRS 和SIRT2 及其H187Y、S368D 突變型是否有相互作用。結果表明：SIRT2 的H187Y 突 變 型 不 再 與SerRS 相 結 合，而S368D 突變卻不影響其與SerRS 的相互作用（圖3B～3C）。

為進一步確認H187 位點突變對其與SerRS 結合的影響，我們構建了SIRT2 H187A 突變型。當187 位點H 突變成丙氨酸（A）時，會降低SIRT2 的去乙酰化酶活性［20］。我們同樣用外源的方法檢測了SIRT2 H187A 與SerRS 的相互作用，發現與H187Y 相比，H187A 與SerRS 的 結 合 相對較強，但仍弱于SIRT2 與SerRS 的相互作用（圖3D）。結果表明，SIRT2 的H187 位點可調控其與SerRS 的相互作用，當H 突變為Y 時產生的影響最大。

SIRT2 突變位點的結構分析SIRT2 上與SerRS 結合的界面包含兩部分，即Gly52-Asp60 和Trp337-Ser356［15］。為了進一步研究SIRT2 H187 位點對其與SerRS 結合的影響，我們嘗試從結構生物學的角度進行深入探討，采用軟件對人源SIRT2（PDB ID 編號：1J8F）的H187Y 突變進行了結構模擬（圖4）。

與野生型相比，187 位點H 突變為Y 時，會與相鄰的Q267 位點發生空間上的沖突。一方面，酪氨酸側鏈比組氨酸的更長，所以與267 位谷氨酰胺羰基氧之間的距離從2.5? 縮短為2.3?，在空間上不合理；另一方面，突變后187 位點酪氨酸殘基側鏈變為負電，且與267 位谷氨酰胺的羰基相斥。由此推測，H187Y 突變體破壞了復合結構中同267 位Q 的相互作用，進而影響SIRT2 的構象，使其與SerRS 相互作用的2 個位點發生了距離改變，進而影響其與SerRS 的相互作用。

SerRS 可被SIRT2 去乙酰化因為SIRT2 能夠與SerRS 相互作用，且SIRT2 是去乙酰化酶，為探究SerRS 是否存在乙酰化修飾，我們通過NAM 處理細胞進行檢測。首先在細胞內進行Flag-SerRS轉染，12 h 后用5 mmol/L NAM 按照0、2、4 h 時間梯度處理，隨后裂解細胞并使用Flag 磁珠進行免疫共沉淀。Western blot 結果顯示，SerRS 存在乙酰化修飾，且隨著NAM 處理時間增加，乙酰化水平不斷提高（圖5A）。因此確定Sirtuins 為SerRS 的去乙酰化修飾酶。

進一步在細胞內共轉染Flag-SerRS 與SIRT2-HA，免疫共沉淀后經Western blot 檢測顯示，SIRT2在細胞內過表達，SerRS 的乙酰化程度下降（圖5B）。因此認為，SIRT2 是SerRS 的去乙酰化酶。

討 論

乙酰化修飾在表觀遺傳及代謝調控中具有重要的作用，其調控的紊亂與許多疾病密切相關，包括神經系統疾病［21］、癌癥［22］和心血管疾病［23］等。心血管疾病作為威脅人類健康的一大疾病，已知的發病機制涉及氧化應激、細胞自噬、細胞的凋亡與再生等，這些都被證明與SIRT2 緊密相關。

心力衰竭是許多心血管疾病常見的終末期病癥，其特征之一是心肌的病理性肥大。有研究發現，與野生型小鼠相比，SIRT2 敲除小鼠在注入血管緊張素Ⅱ后，心肌肥厚、纖維化加重，心臟功能受損。相反，SIRT2 過表達可防止損傷［24］。體外實驗表明，SIRT2 過表達可保護心肌細胞在血清饑餓條件下不發生凋亡，而NAM 則可抑制SIRT2 進而促進心肌細胞凋亡［25］。但是，SIRT2 在心血管疾病中的確切作用仍需要進一步研究，以驗證SIRT2 是否能像SIRT1 或SIRT3 一樣，成為心血管疾病治療或預防的靶點。SIRT2 抑制劑已經在治療神經退行性疾病中顯示出積極的意義，有研究發現抑制SIRT2 可在細胞水平上減少帕金森病相關毒性蛋白α-synuclein 的積累和聚集［26］。

SerRS 定位于細胞質，屬于第二類AARS。其結構中特有的UNE-S 結構域中存在核定位信號（nuclear localization signal，NLS），能引導SerRS 入核［27］，進而參與血管生成的調控。在心血管疾病中，血管生成對梗死后心臟和循環功能的恢復至關重要，血管生成不足會阻止缺血后的恢復，并可能導致心肌梗死后的心力衰竭［28］。研究發現，當斑馬魚體內SIRT2 的蛋白質表達量降低時，VEGFA 的表達量上升，血管生成增加［15］。

SerRS 可以通過招募SIRT2 入核，對VEGFA基因的組蛋白去修飾以抑制其表達。SIRT1 和SIRT2 在血管內皮細胞中高表達，且都可介導氧化應激反應，通過藥物抑制SIRT2 可以降低氧化應激誘導的內皮細胞毒性［29］。我們通過免疫共沉淀驗證了SerRS 能夠與SIRT2 相互作用，而不與SIRT1結合。SIRT2 通過調節α-微管蛋白的乙酰化水平，導致血管重構，從而調節血管緊張素Ⅱ誘導的內皮細胞遷移［30］。以α-微管蛋白為底物，我們發現SerRS 與SIRT2 的相互作用可增強SIRT2 的去乙酰化酶活性。由于SIRT2 主要定位于細胞質中，參與調控多種生理過程，SerRS 也同樣定位于胞質，兩者相互作用后在SerRS 的核定位信號引導下入核。從另一角度說明，SerRS 對SIRT2 酶活的增強作用可能對整體代謝水平產生影響，這為研究心血管疾病提供了一個新的思路。

目前對SerRS 如何在細胞核中控制VEGFA 表達已研究得較為清楚，但其中SerRS 的作用及其激活SIRT2 的機制卻并不清楚。通過數據比對，我們發現SIRT2 的H187 位點保守性較高，而該位點也是SIRT2 的去乙酰化活性的關鍵位點。對該位點的深入探究顯示，H187A 突變可降低SIRT2 去乙酰化酶活性，同時其與SerRS 的結合減弱。而使SIRT2 失活的H187Y 突變則阻斷了SIRT2 與SerRS 的結合。以上結果初步表明，SIRT2 的H187位點對其與SerRS 的結合具有重要的調控作用，尤其是SIRT2 H187Y 突變型不與SerRS 結合。根據上述結果，通過結構模擬發現，187 位點突變為酪氨酸后，會與相鄰的Q267 位點發生空間上的沖突，可能改變SIRT2 構象，進而影響SIRT2 與SerRS 的結合。SerRS 在許多惡性腫瘤中高表達，分析其原因，除了其氨基酰化功能在蛋白質合成中至關重要外，也存在SerRS 參與其他信號通路的調控，進而影響腫瘤發生發展的可能性。可以通過調控SIRT2 的H187 位點來影響SerRS 對SIRT2 的招募及激活作用，同時不影響SerRS 本身的氨酰化活性。

由于SIRT2 為去乙酰化酶，我們通過實驗發現SerRS 存在 乙 酰 化修 飾，且SIRT2 可 調控SerRS 的乙酰化水平。乙酰化修飾與蛋白質降解、核定位等功能相關，同時SerRS 招募SIRT2 入核會影響血管生成，所以SIRT2 對SerRS 乙酰化修飾的調控很可能在該過程中發揮功能。結合上述發現的H187 位點對SIRT2 自身去乙酰化酶活性有重要影響，后續的工作可進一步研究SIRT2 對SerRS 的乙酰化調控機制及其在疾病和腫瘤發生、發展中的作用。

綜上，本研究發現了SerRS 作用于SIRT2 并增強其酶活的潛在位點，拓展了對于SerRS 和SIRT2在許多相關疾病中的認識，并為針對SIRT2 的藥物研發以及相關疾病的治療提供了新的思路。