血管生成素和血小板反應蛋白在復發性流產（RSA）患者絨毛組織中的表達及其與血管生成的關系

趙駿達 梁凌云 武 欣

（1新疆醫科大學第一附屬醫院婦科 烏魯木齊 830011；2復旦大學附屬婦產科醫院婦科 上海 200011）

復發 性流產（recurrent spontaneous abortion，RSA）是一種常見的婦產科疾病，對患者及其家庭造成極大的精神壓力［1］。研究報道染色體異常、自身免疫系統紊亂、內分泌失調等均會導致流產，但目前仍有半數RSA 患者的病因不明［2-4］。順利妊娠的必要條件是胎盤絨毛正常的血管發生和血管新生，并且與多種促血管生成因子和抑制因子協調作用［5-6］。近些年研究發現血管生成素（angiopoietin，Ang）家族是由血管內皮細胞分泌的一類與血管生成有關的蛋白質生長因子［7］。血小板反應蛋白（thrombospondin，TSP）是一種多功能糖蛋白，對血管生成起著重要作用［8］。而微血管密度（microvessel density，MVD）是血管形成的量化指標，CD34 等是其 標 記 物［9］。本 研 究 選 取2015 年6 月—2016 年6 月收入婦產科的50 例流產清宮術患者為研究對象，通過檢測患者新鮮絨毛中Ang 及TSP 的表達水平，并檢測CD34 陽性和MVD，分析其與血管生成的關系，為臨床治療提供理論依據。

資料和方法

一般資料選取2015 年6 月—2016 年6 月復旦大學附屬婦產科醫院婦科50 例流產清宮患者為研究對象，對照組為正常妊娠行人工流產者，RSA 組為≥2 次自然流產者，每組25 例。對照組年齡為20～38 歲，平均年齡為（29.81±2.58）歲。納入標準：（1）本次妊娠無流產癥狀；（2）孕周≤10 周；（3）超聲確診早孕，可見胚芽及心管搏動；（4）既往有正常分娩史而無不良孕產史。RSA 組年齡為20～39歲，平均年齡為（30.51±2.42）歲。納入標準：（1）超聲檢查子宮發育正常；（2）孕周≤10 周；（3）夫婦染色體核型檢查正常；（4）甲狀腺功能檢查正常；（5）無血栓形成傾向；（6）排除免疫及感染因素影響。兩組患者孕周、孕次、年齡差異均無統計學意義。本研究獲本院醫院倫理委員會批準，所有患者自愿簽署知情同意書，并在人工流產時留取標本。

Ang 和TSP 相關指標表達的檢測采用免疫組化SP 法檢測兩組患者新鮮絨毛組織中Ang-1、Ang-2 的表達；試劑盒購于上海恪敏生物科技有限公司，嚴格按照說明書進行操作。采用圖像分析軟件Image 通過檢測陽性產物的積分光密度值（IOD值），對Ang-1、Ang-2、TSP-1 和TSP-2 行半定量分析。陽性反應越強烈則染色越深，對于Ang，IOD 值越大，表達水平越高。而對于TSP，染色越深則IOD 值越小，表達水平越高。

CD34 陽性和MVD 的判定方法對兩組患者的組織血管進行免疫組化染色，CD34 陽性指血管內皮細胞胞質染色呈棕黃色。微血管判斷標準：根據CD34 標記的血管內皮的數目計數微血管數量，將管腔＜8 個紅細胞的血管或血管內皮細胞簇（包括單個內皮細胞著色）作為一個計數單位。MVD計算方法：計數5 個視野內的微血管數目，取其平均值為MVD。

統計學方法采用軟件SPSS 20.0 進行數據統計分析，計量資料以x±s表示，采用t檢驗；計數資料采用χ2檢驗，檢驗標準均為α=0.05。數據相關分析采用pearson 相關分析法。P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

兩組患者絨毛組織中Ang-1、Ang-2 的表達水平及Ang-1/Ang-2 值的比較兩組患者的絨毛組織中均有Ang-1、Ang-2 表達，RSA 組絨毛組織中Ang-1、Ang-2 的表達顯著高于對照組（P＜0.05），Ang-1/Ang-2值顯著高于對照組（c2=3.54，P=0.001，表1）。

兩組患者絨毛組織中TSP-1、TSP-2 的表達水平及TSP-1/TSP-2 值的比較兩組患者的絨毛組織中均有TSP-1、TSP-2 表達，RSA 組絨毛組織中TSP-1的表達顯著低于對照組，TSP-2 的表達顯著高于對照組，TSP-1/TSP-2 比值顯著低于對照組（c2=23.57，P ＜0.001，表2）。

表1 兩組患者絨毛組織中Ang-1、Ang-2 的IOD 值及Ang-1/Ang-2 值的比較Tab 1 Comparison of IOD values of Ang-1，Ang-2 and Ang-1/Ang-2 in villus tissues between the two groups（x±s）

表2 兩組患者絨毛組織中TSP-1、TSP-2 的IOD 值及TSP-1/TSP-2 值的比較Tab 2 Comparison of IOD values of TSP-1，TSP-2 and TSP-1/TSP-2 in villus tissues between the two groups（x±s）

兩組患者絨毛組織的MVD 值比較RSA 組絨毛組織中的MVD 值為20.0±1.4，對照組絨毛組織中 的MVD 值 為29.9±3.8，RSA 組 的MVD 值 顯 著低于對照組（t=12.22，P＜0.001）。

RSA 組患者絨毛組織中各指標的相關性分析結果顯示Ang-1 的表達與MVD 呈負相關性（r=-0.314，P＜0.05），Ang-2 的表達與MVD 呈正相關性（r=0.951，P＜0.05），TSP-1、TSP-2 的 表 達 與MVD 值呈負相關性（r=-0.746，r=-0.773，P＜0.05）。

討 論

妊娠是一個復雜的過程，在妊娠早期胚胎發育過程中，血管發生和血管新生形成血管系統，而血管生成受多種血管相關因子協調作用，包括促血管生成因子、抑制因子等，因此影響血管系統形成的因素均可能導致流產［10］。另一方面，血管相關因子影響婦女的卵巢及子宮內膜血流灌注和功能，而妊娠結局與卵巢和子宮內膜功能密切相關，因此血管相關因子的表達異常可能引起RSA［11］。

Angs 家族包括Ang-1 和Ang-2，兩者均可作用于內皮特異性受體酪氨酸激酶Tie-2，從而影響血管內 皮 形 成［12］。研 究 發 現 在 妊 娠 過 程 中，Ang-1 及Ang-2 的正常表達有助于胚胎正常生長發育，而其過度表達會造成血管缺陷，從而導致胚胎死亡，引發RSA［13］。MVD 作為一種量化血管生成的指標，可用于微血管生成計數，以反映血管生成程度。本研究結果顯示，RSA 組絨毛組織中Ang-1、Ang-2 及Ang-1/Ang-2 值顯著高于對照組，推測RSA 患者體內絨毛組織的Ang-1、Ang-2 高度表達可能會導致RSA，尤其是Ang-1 高表達。

TSP 包括TSP-1 和TSP-2，其對血管生成起重要作用，其表達異常將會影響血管生成，從而影響胚胎的血液供應，嚴重者將導致流產［14］。TSP-1 作為一種內源性血管生成抑制因子，對血管內皮生長因子具有拮抗作用，但也有研究表明TSP-1 可以促進血管生成［15］。本文研究結果顯示RSA 組絨毛組織中TSP-1 表達水平顯著低于對照組，與TSP-1 促進血管生成作用的觀點相符。TSP-2 表達水平顯著高于對照組，TSP-1/TSP-2 值顯著低于對照組，同理推測RSA 患者體內絨毛組織TSP-2 的高表達可能通過影響血管生成而導致流產。

本研究結果顯示，RSA 組的絨毛組織中MVD值顯著低于對照組，說明RSA 的發生受患者絨毛組織中血管生成程度降低的影響。RSA 組患者絨毛組織中，Ang-1 表達與MVD 值呈負相關性，Ang-2表達與MVD 值呈正相關性，TSP-1、TSP-2 表達與MVD 值均呈負相關性。與上述推測相符，進一步證實Ang-1、TSP-2 高表達可能導致流產發生。可能由于樣本量小的原因，本研究中Ang-2 和TSP-1在相關性分析中未達到預期效果。

綜上所述，RSA 患者絨毛組織中均有Ang-1、Ang-2、TSP-1 和TSP-2 表達，在妊娠過程中絨毛組織的血管生成非常重要，其正常表達對維持正常妊娠具有重要作用。RSA 的機制可能為Ang、TSP 異常表達導致血管生成障礙，從而影響胚胎發育，導致流產。鑒于本研究為血管生成相關因子、MVD與RSA 的相關性研究，且病例數有限，在擴大樣本量的基礎上還需詳細研究上述三者的因果關系，為RSA 患者病因研究提供新的理論。