轉移相關蛋白在乳腺癌原發灶與復發/轉移灶中的表達及意義

曹利娟 包 蕓 王文娟 唐 峰

（1復旦大學附屬華山醫院病理科 上海 200040；2復旦大學附屬華山醫院北院病理科 上海 201901）

近年來，乳腺癌在我國的發病率呈現出逐年上升的趨勢，發病年齡也出現了年輕化的勢頭［1］。盡管乳腺癌的早期診斷措施與輔助治療方法在不斷進步，乳腺癌的復發轉移仍然是影響乳腺癌患者生活質量及其預后的重要原因［2-3］。

轉移相關蛋白有許多種，如雌激素受體（estrogen receptor，ER），孕激素受體（progesterone receptor，PR），人表皮生長因子受體2（CerbB-2）和增殖細胞核抗原（Ki67）等，是臨床病理工作中常用的診斷及鑒別診斷指標，對于乳腺癌治療方法的選擇和預后的判定有指導作用，是目前公認的且備受重視的指標。其中浸潤性導管癌中HER-2 和Ki67蛋白的表達與組織學分級、有無轉移呈正相關［4-5］。

以往文獻中轉移灶通常納入前哨淋巴結［6］或者腋淋巴結［7-9］有轉移的病例，且研究多集中在與治療及分子分型密切相關的ER、PR、CerbB-2、Ki67 等轉移相關蛋白，發現原發灶與前哨淋巴結或腋淋巴結轉移灶中相關轉移蛋白的表達有差異，且會影響乳腺癌分子分型及治療方法的選擇。本研究不同之處為比較異時的遠處器官或遠處淋巴結的轉移灶與乳腺癌原發灶之間轉移相關蛋白的表達差異情況，此類轉移灶細胞可能具有更強的異質性與轉移侵襲力，以往文獻中較少報道且結論不一［10-14］。

我們發現多藥耐藥（multiple drug resistance，MDR）藥物可以誘導乳腺癌細胞發生MDR，同時也可誘導轉移相關蛋白CD147、MMPs 和EGFR 的表達，從而增強癌細胞的侵襲轉移能力。有研究報道CD147 在乳腺浸潤性導管癌中高表達，在乳腺癌的發生發展中發揮重要作用。EGFR 異常陽性會導致乳腺癌復發時間縮短、復發率升高、存活期變短等［15］。RAC1 蛋白在乳腺癌的發生和發展中起著舉足輕重的作用，亦能通過一定的機制參與乳腺癌的侵襲和轉移［16］。人UHRF-1 是近年熱點研究的基因，其在乳腺癌腫瘤細胞生長、表達情況及與患者臨床特點的關系及對復發轉移的影響尚未不明確。最終我們將轉移相關蛋白ER、PR、CerbB-2、Ki67、EGFR、CD147、RAC1 和UHRF-1 納入本研究，比較其在乳腺癌原發灶與復發/轉移灶中的差異表達情況，探討其臨床意義及對患者預后的影響。

資料和方法

標本來源本課題經復旦大學附屬華山醫院倫理委員會批準。所有標本來自復旦大學附屬華山醫院病理科，于2001—2016 年被診斷為乳腺浸潤性導管癌，術前均未發現有遠處轉移灶，術后發生復發/轉移的病例共69 例（隨訪截至2016 年12 月31日，平均隨訪時間8.2 年，最短3 年，最長13 年）。篩選條件：術式為改良根治術，術后使用相同化療方案（CET），均經內分泌治療，均未經放射治療及靶向藥物治療，且有隨訪結果的患者。最終確定符合標準的病例共31 例（隨訪時間15 年），病理均證實為浸潤性導管癌，組織學分級為Ⅰ級2 例、Ⅱ級18例、Ⅲ級11 例，腫塊大小為≤2 cm 14 例、＞2 cm 17例，腋下淋巴結轉移20 例、無轉移11 例，復發轉移時 間≤2 年19 例、＞2 年12 例，結 局 為 存活26 例、死亡5 例。

表1 免疫組織化學抗體一覽表Tab 1 Panel of antibodies for immunohistochemistry

染色結果判讀所有標本的染色結果判讀由病理科醫師進行，并由其上級醫師復核確定。

ER 和PR ER 和PR 的 陽性 部 位 是細胞 核，其分級按細胞陽性數量所占的比例及著色深度分別計分：比例為0 時記0 分，1%～30%記1 分，31%～60% 記2 分，大 于60% 記3 分；細 胞 無 著 色 時 記0分，淺棕黃色記1 分，正常棕黃色記2 分，深棕黃色記3 分。根據細胞陽性數量百分比及染色深度兩項指標的得分之和將最終結果劃分為4 個等級：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為陽性（++），5～6 分為強陽性（+++）。

所有病例CerbB-2 均經FISH 檢驗，其中判讀為+++和經FISH 檢測為陽性的為擴增組，其余為陰性［17-18］。

EGFR 和CD147 EGFR 和CD147 的陽性部位大多反應在細胞膜上，少量可存在于細胞質內。光鏡下觀察免疫組化切片，按被染成陽性的腫瘤細胞占總數的百分比和染色深度分別計分：未著色記為0 分，1%～50% 為1 分，51%～80% 為2 分，大 于80%為3 分；染色深度：無著色時為0 分，淺棕黃色時為1 分，棕黃色為2 分，深棕黃色為3 分。根據陽性細胞所占比例及染色深度兩項指標的分數之和分為4 個等級：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為陽性（++），5～6 分為強陽性（+++）。

RAC1 RAC1 著色部位主要在細胞質內，偶爾可在細胞核中。RAC1 染色評分由腫瘤細胞被染為陽性的百分比例和染色強度綜合評價組成。腫瘤細胞被染為陽性的百分比例分為4 個等級：無陽性細胞時為0 分，1%～30% 為1 分，31%～60% 為2分，大于60%為3 分；染色強度：無著色時為0 分，淺棕黃色時為1 分，棕黃色為2 分，深棕黃色為3 分；根據陽性細胞所占比例及染色深度兩項指標的分數之和分為4 個等級：0 分為陰性（-），1～2 分為弱陽性（+），3～4 分為陽性（++），5～6 分為強陽性（+++）。

UHRF-1 UHRF-1 的顯色部位也是細胞核，其級別的劃分也按照陽性細胞百分數和染色深度兩項指標綜合評級。細胞核未著色或全部為輕度著色或＜30%的腫瘤細胞核表現為中等的棕黃色著色為0 級；30%～70%的細胞核表現為中等著色的棕黃色或＜30%的細胞核強著色記為1 級；腫瘤細胞核著色比例＞70%或細胞核強著色比例＞30%時記為2 級。

Ki67 Ki67 以腫瘤細胞的細胞核被染為棕黃色記作陽性。對每張組織的免疫組化切片取10 個高倍視野（隨機），以陽性細胞所占比例的平均值定義為陽性細胞率（%）。當陽性細胞所占百分比≤10%為1；11%～25%為2；26%～75%為3；＞75%為4；并重復判讀一次計數，然后把2 次計數結果的平均值作為最終結論。

由于樣本數量較少，故分析時將EGFR、CD147和RAC1 的-與+（或UHRF1 組0 和1，Ki67 組1 和2）結果歸為低表達組，將EGFR、CD147 和RAC1的++和+++結果（或UHRF-1 組2 和Ki67 組3 和4）歸為高表達組。

在對新型城鎮化的研究上，王如松指出一要“用質量型的城鎮化取代過去數量型的城鎮化：城鎮建設要以提升城市的文化、公共服務等內涵為中心，改變以前盲目擴大城市規模的發展模式，是使城鎮成為真正意義上的適宜人居之所”；二要“用統籌兼顧的城鎮化取代過去單一偏向的城鎮化：從重經濟轉向社會協調發展，從重工業轉向多產業融合的新產業體系”。

統計學處理使用SPSS 21.0 軟件包分析處理，計數資料的組間比較運用χ2檢驗或Fisher 確切概率法，P＜0.05 為差異有統計學意義。運用GraphPad Prism 5.0 軟件分析蛋白表達水平與術后無病生存時間（disease-free survival，DFS）的關系。

結 果

一般情況31 例患者中復發病例6 例：位于同側乳腺組織內者4 例，雙側乳腺癌者2 例；轉移病例25 例，分別為轉移至胸壁16 例、鎖骨上淋巴結2 例、鎖骨下淋巴結1 例、頸部淋巴結1 例、肺2 例、肝1 例和骨2 例。經2016 年隨訪證實5 例因腫瘤復發進展死亡，26 人存活。

原發灶與復發/轉移灶各蛋白表達差異情況原發灶與復發/轉移灶各蛋白不同表達水平的病例數中，除了RAC1，其他指標的病例數差異無統計學意義（表2）。

RAC1 蛋白表達水平與乳腺癌患者臨床特點及預后的關系發生淋巴結轉移的患者RAC1 蛋白高表達比例為35.0%（7/20），高于淋巴結無轉移患者的0（0/11），腫塊≤2 cm 的乳腺癌患者RAC1 蛋白高表達為14.3%（2/14），顯著低于腫塊＞2 cm 的乳腺癌患者（70.6%，12/17），結果均有統計學意義（χ2=4.973，P=0.033；χ2=9.827，P=0.002）（表3）。

8 種轉移相關蛋白表達水平與患者DFS 的關系隨訪 截 至2016 年12 月31 日，31 例中5 人因腫瘤復發進展死亡，26 人存活。ER、PR、CD147 高表達 DFS 長，而 CerbB-2、Ki67、EGFR、RAC1、UHRF-1 高表達者DFS 短。8 種轉移相關蛋白表達水平與患者術后DFS 的關系見圖1 和圖2。

討 論

本研究主要采用免疫組化方法檢測了乳腺癌原發灶及復發/轉移灶中ER、PR、CerbB-2、Ki67、EGFR、CD147、RAC1 及UHRF-1 蛋白的表達差異情況，結果發現復發/轉移灶中RAC1 由22.6%（7/31）顯著上升到48.4%（15/31），且差異具有統計學意義（χ2=4.509，P=0.034）。

表2 原發灶與復發/轉移灶各蛋白不同表達水平的例數Tab 2 The number of cases with different protein expression levels in primary and recurrent metastasis （n=31）

RAC1 在腫瘤發生發展中的作用RAC1 是Rho 蛋白家族成員之一，多種Rho 蛋白家族成員與惡性腫瘤細胞的表達、浸潤性及轉移具有相關性。RAC1 在某些基因轉錄過程中發揮調節作用，從而干預乳腺癌細胞的增殖、凋亡等過程［19］。RAC1 可以通過調節某些轉錄因子的活性如AP-1、NFκB等，從而干擾cyclin D1 的表達，參與乳腺癌細胞周期調控［20］。

RAC1 通過PAK1 激活Limk，從而抑制Cofilin對肌動蛋白的解聚作用［21］。RAC1 蛋白的表達是乳腺癌患者獨立的預后相關分子指標，其表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、臨床分期和組織學分級具有顯著的相關性［22-23］。

表3 腫瘤原發灶RAC1 表達情況與乳腺癌臨床特點及預后的相關性Tab 3 The correlation between the expression of RAC1 in primary tumor and the clinical features and prognosis of breast cancer （n=31）

Wnt5a/Dvl2/RAC1 信號通路對MDA-MB-231人乳腺癌細胞的遷移具有調控作用，且RAC1 位于Wnt5a/Dvl2/RAC1 信號通路的下游，高表達的RAC1 可促進MDA-MB-231 人乳腺癌細胞的遷移，干擾RAC1 的表達可顯著降低其遷移［24-25］。通過RAC1-PAK1 信號通路，RAC1 可促進腫瘤細胞的遷移，若在乳腺癌細胞中加入PAK1 抑制劑，高遷移能力的乳腺癌細胞的遷移能力會受抑制；PAK1 的表達會隨著干涉RAC1 的表達而下降，說明PAK1受到RAC1 表達的調控，參與調節乳腺癌細胞的遷移運動［26-27］。細胞極性的改變往往與腫瘤細胞的侵襲和轉移有關，在乳腺浸潤性導管癌中，細胞極性部分反轉的病例淋巴結的轉移率高于沒有細胞極性反轉的病例且預后較差，RAC1 在細胞極性部分反轉的病例中的表達水平明顯高于沒有反轉的病例，RAC1 高表達可能引起乳腺浸潤性導管癌細胞極性的改變，導致更差的預后［26］。

本研究共納入31 例患者，與原發灶相比，復發/轉移灶中RAC1 蛋白表達水平顯著升高；RAC1 高表達者DFS 短。而我們關于RAC1 表達水平與乳腺癌患者臨床病理特點相關性的研究結果（發生淋巴結轉移的患者RAC1 蛋白高表達比例高于淋巴結無轉移患者；腫塊≥2 cm 的RAC1 蛋白高表達比例顯著高于腫瘤＜2 cm 的；臨床分期較高的RAC1 蛋白高表達的比例高于低臨床分期患者；死亡患者中RAC1 蛋白高表達比例高于存活患者的）與以往的結論相符合。RAC1 的表達有助于預測乳腺癌的侵襲轉移、判斷乳腺癌患者的預后。有文獻報道RAC1 作為針對腫瘤細胞遷移及抑制腫瘤血管生成的靶向藥物，并針對肺癌患者應用［19，27］。乳腺癌原發灶與復發/轉移灶中RAC1 表達的差異性研究尚無報道，猜測這種差異或許與治療方法和殘存有較強轉移能力的腫瘤細胞相關。

EGFR和CD147在乳腺癌組織中的表達EGFR是一種絡氨酸激酶的細胞受體，通過結合相應的配體，激活絡氨酸激酶，從而引起細胞的過度分裂、增殖及惡變。同時，EGFR 與腫瘤的發生和增殖的失控密切相關。實驗表明EGFR 的高表達或異常表達在腫瘤中非常 顯 著［19，28］。我們以往的 研 究［29］發現，短期化療后EGFR 的表達明顯增強，EGFR 過表達的患者更容易有淋巴結轉移。本次研究發現，死亡病例中EGFR 陽性表達比例為60.00%（3/5），遠高于存活病例的陽性表達比例3.84%（1/26），且差異具有統計學意義（P＜0.05），即患者如果EGFR 陽性，則傾向于預后更差以及死亡率更高，這與之前的研究結論相符。CD147 是跨膜糖蛋白分子的一種，屬于免疫球蛋白超家族（IgSF），CD147 分子廣泛表達于身體各部分的組織，但正常情況其表達程度一般較低［29］。有研究發現CD147 對乳腺癌的侵襲和轉移有明顯的促進作用，高表達CD147 的病例生存比例明顯低于低表達病例組［30-32］。由于本次研究并未發現原發灶與復發/轉移灶中二者的差異，故無法深入討論和分析。

ER、PR、CerbB-2、Ki67 和UHRF-1 在乳腺癌組織中的表達乳腺是ER 和PR 的靶器官，在正常乳腺上皮細胞的細胞核中二者同時存在并且保留在乳腺癌細胞中［33］。CerbB-2 是與乳腺癌的發生、發展密切相關的原癌基因，是重要的預測和判斷乳腺癌預后的獨立指標［33］，作為生物學標志常用于乳腺癌的診斷和治療。CerbB-2 蛋白在原發灶和腋窩轉移淋巴結表達情況的研究較多，但報道原發灶與復發及遠處轉移灶之間表達差異的文獻并不多且結論不一［34］。1983 年，Gerdes 等［35］首先發現了Ki67 是一種僅在增殖細胞中表達的核抗原，是檢測腫瘤細胞增殖活性最可靠的指標之一。Fasching 等［36］的研究表明，Ki67 能夠準確地反映腫瘤的惡性擴散情況，與腫瘤的發生、發展、轉移及預后相關，對腫瘤生物學行為的研究和判斷腫瘤的惡性程度至關重要［37-38］。UHRF-1 基因是近來年發現的較新的基因，人和小鼠的UHRF-1 基因的氨基酸序列的同源性為73.7%。小鼠UHRF-1 基因對細胞周期進程和細胞增殖的調節及細胞放射敏感性等方面有影響，而人類UHRF-1 的生物學功能尚不清楚。李新莉等［39］通過穩定轉染技術，提高了人乳腺癌細胞BT-549 中UHRF-1 的 表達水平，并 通過MTT 方法觀察了增加人UHRF-1 的表達對乳腺癌細胞生長的影響，結果發現轉染了人UHRF-1 的BT-549 人乳腺癌細胞生長速度明顯加快。而另一項研究發現UHRF-1 蛋白在乳腺癌中的陽性表達率高于癌旁正常組織，且與乳腺癌的分期及放療后胸壁局部復發有關［40］。

本研究觀察了原發灶與復發灶或轉移灶之間ER、PR、CerbB-2、Ki67、UHRF-1 抗體表達的差異狀況及其與乳腺癌患者術后DFS 的關系。以往文獻推測原發灶與復發/轉移灶的差異表達原因主要有：乳腺癌的高度異質性在疾病的發生發展及治療過程中可能伴有腫瘤細胞受體狀態的改變［41］；也不排除檢測方法、組織處理［42］和抗體克隆號及廠家的影 響。本 研 究 未 發 現ER、PR、CerbB-2、Ki67 和UHRF-1 蛋白在腫瘤原發灶與復發/轉移灶中表達水平有顯著差異，可能與樣本量較小也有關系。蛋白之間的作用是相互的，不能憑借單一指標去推測乳腺癌的臨床表現及預后。

綜上所述，轉移相關蛋白直接或間接參與了乳腺癌的分化、增殖和侵襲轉移，同時可以預測乳腺癌的預后，因此，探究這些指標內在的相互作用及對乳腺癌腫瘤細胞的作用機制十分有意義。聯合檢測原發灶與復發/轉移灶中相關指標的表達情況可以進一步幫助臨床醫師判斷患者的預后，選取適合患者的最佳治療方案，也可能為乳腺癌靶向治療藥物提供新的研究方向。