非小細(xì)胞肺癌患者癌組織及血清中circRNA的表達(dá)水平及臨床意義

楊桄權(quán) 張千仕 范習(xí)剛 吳飛

肺癌作為一種惡性程度較高、發(fā)病率高居世界第一位的腫瘤疾病，在世界范圍內(nèi)均為較嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，其中非小細(xì)胞肺癌（Non small cell lung cancer，NSCLC）占比最高［1］。肺癌在我國(guó)的發(fā)病率較高的原因在于未受控制的煙草消費(fèi)、日益嚴(yán)重的環(huán)境污染和生活習(xí)慣改變，雖然疾病診斷和治療都有較大進(jìn)步，但其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移機(jī)制尚未明確，且早期診斷較為困難，因此患者5年生存率仍較低［2］。若能在肺癌患者早期予以確診并實(shí)施有效的治療方式，則可顯著延長(zhǎng)患者生存期，提高生存質(zhì)量［3］。組織病理學(xué)作為診斷金標(biāo)準(zhǔn)一般需通過(guò)手術(shù)或穿刺獲取靶組織，對(duì)患者有一定的生理、心理創(chuàng)傷，而臨床常見(jiàn)的血清腫瘤標(biāo)記物在早期診斷方面缺乏足夠的靈敏度［4］。因此尋找創(chuàng)傷小、穩(wěn)定性好、靈敏度高的新型生物標(biāo)志物對(duì)NSCLC 的診斷和治療有積極意義。本研究旨在探討NSCLC 患者癌組織及血清中環(huán)狀RNA（circRNA）的臨床意義，為疾病診斷提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料

選擇2019年1月至2019年12月于本院進(jìn)行手術(shù)治療的56 例NSCLC 患者為研究對(duì)象。收集其中10 例患者的病理組織標(biāo)本，要求癌組織經(jīng)冰凍切片后組織HE 染色顯示癌細(xì)胞比例≧70%；取癌組織外緣5 cm 處的癌旁組織為對(duì)照組，要求染色后顯示不含癌細(xì)胞，且經(jīng)免疫組化ABC 法染色為陰性。10 例患者中男性7 例，女性3 例；年齡（62.13±8.24）歲；肺鱗癌6 例，肺腺癌4 例；TNM 分期Ⅰ期4 例，Ⅱ期5 例，Ⅲ期1 例；低度分化7 例，中度分化3 例；吸煙或戒煙者6 例，未吸煙者4例。余下46 例NSCLC 患者進(jìn)行血清circRNA 檢測(cè)，其中男性32 例，女性14 例；年齡（60.48±9.15）歲，收集病理類型、臨床分期、分化程度、吸煙狀態(tài)等資料。按照1∶1 進(jìn)行匹配，選擇46 例健康志愿者為對(duì)照組進(jìn)行血清circRNA 檢測(cè)，均無(wú)惡性腫瘤疾病家族史，既往無(wú)放化療史，其中男性30 例，女性16 例；年齡（61.57±8.85）歲。NSCLC 組和對(duì)照組性別、年齡比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

入組標(biāo)準(zhǔn)①年齡≧18 歲，性別不限；②經(jīng)病理組織檢查確診為NSCLC；③術(shù)前血常規(guī)、心電圖、肝腎功能等檢查均達(dá)治療要求；④術(shù)前無(wú)嚴(yán)重合并癥，無(wú)手術(shù)禁忌癥；⑤患者自愿簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)①病理資料不全，TNM 分期不詳者；②合并其他惡性腫瘤者；③術(shù)前接受放化療治療者；④患者依從性差，不能配合研究者。

1.2 方法

1.2.1 癌組織和癌旁組織檢測(cè)

①使用TRIzol 試劑盒（美國(guó)Invitrogen 公司提供）分別提取10 例患者的癌組織和癌旁組織中的總RNA，測(cè)定RNA 在260、280、230 nm 處的吸光度值，計(jì)算濃度并估算純度，用甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)RNA 的純度和完整性。②使用RNaseR（美國(guó)Epicentre 公司提供）除去標(biāo)本總RNA 中的線性RNA，采用Super RNA Labeling（美國(guó)Arraystar 公司提供）對(duì)RNA 進(jìn)行cDNA 擴(kuò)增和熒光標(biāo)記。③將標(biāo)記后的樣本和Human circRNA Array V2（8×15K）芯片（美國(guó)Arraystar 公司提供）進(jìn)行排列雜交，用清洗液試劑盒（美國(guó)Agilent 公司提供）進(jìn)行清洗。④上海康成生物公司提供circRNA 芯片檢測(cè)、圖像采集、數(shù)據(jù)分析等。

1.2.2 血清檢測(cè)

采集肺癌患者和對(duì)照組對(duì)象清晨空腹肘靜脈血5 mL，離心分離血清保存，用TRIzol LS 試劑（美國(guó)Invitrogen 公司提供）提取血清總RNA，分光光度計(jì)測(cè)定RNA 濃度，將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA 為模板進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，以2-ΔΔCt值表示目的circRNA 的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)；符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；采取受試者工作曲線（ROC）分析血清circRNA 對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值，記錄曲線下面積（AUC）；應(yīng)用G2505C 基因芯片掃描儀（美國(guó)Agilent 公司提供）掃描組織標(biāo)本Cy3 熒光強(qiáng)度，采用Agilent Feature Extraction software 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，使用R 平臺(tái)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化處理，對(duì)篩選出的差異表達(dá)circRNA 繪制火山圖，進(jìn)行聚類分析，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NSCLC 患者組織中circRNA 差異表達(dá)分析

R 平臺(tái)DESeq2 軟件篩選出癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)顯著的circRNA 共181 個(gè)（Fold change≧2 或≦-2），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），繪制火山圖，其中117 個(gè)表達(dá)上調(diào)（紅色區(qū)域），64 個(gè)表達(dá)下調(diào)（藍(lán)色區(qū)域），見(jiàn)圖1。

圖1 circRNA 差異表達(dá)火山圖Figure 1 Volcano plot of circRNA differential expression

2.2 circRNA 聚類分析

根據(jù)各組標(biāo)本circRNA 表達(dá)量的高低不同繪制聚類分析圖，圖中紅色表示circRNA 表達(dá)量相對(duì)高，綠色表示表達(dá)量相對(duì)低，差異表達(dá)的circRNA可明顯區(qū)分癌組織和癌旁組織，見(jiàn)圖2。

圖2 circRNA 差異表達(dá)聚類分析圖Figure 2 Cluster analysis of circRNA differential expression

2.3 NSCLC 患者血清circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系

NSCLC 患者血清circRNA 表達(dá)水平與性別、年齡、吸煙狀態(tài)、分化程度、病理類型、臨床分期均無(wú)顯著相關(guān)性（P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 NSCLC 患者血清circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship between serum circRNA expression and clinical features in patients with NSCLC（±s）

表1 NSCLC 患者血清circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系（±s）Table 1 Relationship between serum circRNA expression and clinical features in patients with NSCLC（±s）

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2.4 血清circRNA 對(duì)NSCLC 的診斷價(jià)值分析

NSCLC 組患者血清circRNA 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（t=5.052，P＜0.05）。繪制ROC 曲線，結(jié)果顯示，血清circRNA 診斷NSCLC 的敏感度為80.43%，特異度為58.70%，AUC 值為0.752（95%CI：0.651～0.836），見(jiàn)圖3。

圖3 血清circRNA 診斷NSCLC 的ROC 曲線Figure 3 ROC curve of serum circRNA for NSCLC diagnosis

3 討論

肺癌是較為嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問(wèn)題，臨床上十分重視對(duì)肺癌發(fā)生機(jī)制及診斷治療措施的研究，目前認(rèn)為基因的表達(dá)和調(diào)控直接參與到惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中［5］。人類基因組中超過(guò)90%的基因不具有編碼蛋白質(zhì)的能力，可被轉(zhuǎn)錄成非編碼RNA（ncRNA），既往已有研究表明ncRNA 的異常表達(dá)能夠影響肺癌的發(fā)生和發(fā)展［6］。隨著高通量測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，哺乳動(dòng)物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)大量?jī)?nèi)源性的circRNA，不僅擴(kuò)充了ncRNA 家族的范疇，也被發(fā)現(xiàn)具備特定的生物學(xué)功能，可參與多種疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，在多種類別腫瘤細(xì)胞（包括直腸癌、肺癌等）的克隆形成、增值、凋亡、侵襲、轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用［7-8］。

circRNA 作為一種具有特殊結(jié)構(gòu)耐受核酸外切酶降解的內(nèi)源性ncRNA，在人體細(xì)胞中表達(dá)廣泛、豐度高，多數(shù)在進(jìn)化上存在高度序列保守性，結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，具有組織特異性表達(dá)和時(shí)序特異性表達(dá)的特征［9］。ncRNA 多由外顯子環(huán)化形成，主要位于細(xì)胞質(zhì)中，具備微小RNA（miRNA）反應(yīng)元件，可與miRNA 結(jié)合阻礙其與mRNA 的靶點(diǎn)結(jié)合，抑制miRNA 功能，或參與調(diào)節(jié)miRNA 降低活性，從而在疾病中發(fā)揮重要作用［10］。火山圖分析發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)顯著的circRNA 中有117 個(gè)表達(dá)上調(diào)，64 個(gè)表達(dá)下調(diào)，據(jù)此推測(cè)差異表達(dá)的circRNA多數(shù)在NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中可能起到促癌作用。聚類分析結(jié)果顯示表達(dá)差異的circRNA 在癌組織和正常組織中表達(dá)有顯著差異，可用于區(qū)分NSCLC 癌組織和癌旁組織，對(duì)火山圖分析的結(jié)果有較好的補(bǔ)充作用。但本研究篩選的樣本數(shù)量較少，存在一定局限性，尚需進(jìn)行大樣本的臨床研究和基礎(chǔ)研究加以證實(shí)，并進(jìn)一步探討circRNA 在肺癌發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制。

本研究結(jié)果推測(cè)circRNA 在疾病進(jìn)展中有一定促進(jìn)作用，與癌組織檢測(cè)結(jié)果相互印證，具有較高的可靠性。組織細(xì)胞壞死凋亡后的碎片通過(guò)囊泡釋放至血液中形成的循環(huán)游離RNA 被認(rèn)為是血清circRNA 的主要來(lái)源，血清中囊泡存在circRNA 的富集［11］，分析認(rèn)為circRNA 在癌組織和血清中的表達(dá)水平存在一定相關(guān)性，今后可針對(duì)血清circRNA 的來(lái)源問(wèn)題進(jìn)行進(jìn)一步的研究。采取ROC 曲線結(jié)果顯示，該血清指標(biāo)診斷NSCLC 的效能較高。分析認(rèn)為，血清circRNA 具備作為NSCLC 無(wú)創(chuàng)性診斷標(biāo)志物的潛質(zhì)，結(jié)合癌組織檢測(cè)結(jié)果作出綜合判斷，可為未來(lái)NSCLC 的臨床診斷和靶向治療提供一定的參考。本研究對(duì)NSCLC患者血清circRNA 表達(dá)水平與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，血清circRNA 水平與性別、年齡、吸煙狀態(tài)、分化程度、病理類型、臨床分期均無(wú)顯著相關(guān)性，可能與入組病例數(shù)過(guò)少有關(guān)，或與病例選擇存在偏倚有關(guān)。

綜上所述，NSCLC 癌組織和癌旁組織的circRNA 表達(dá)存在顯著差異，血清circRNA 對(duì)NSCLC有較好的診斷價(jià)值，circRNA 可能與疾病進(jìn)展存在一定關(guān)聯(lián)。臨床應(yīng)進(jìn)一步深入研究circRNA 參與NSCLC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程及作用機(jī)制，為該疾病的早期診斷、靶向治療及預(yù)后評(píng)估提供新思路。