酪氨酸激酶抑制劑對CD19 CAR-T細胞在難治/復發Ph陽性急性淋巴細胞白血病中擴增的影響

呂翠翠， 李 新，李 青，穆 娟，王 嘉，袁 婷，江嫣雨，鄧 琦

(天津市第一中心醫院 血液科，天津 300192)

費城染色體(Philadelphia chromosome, Ph)陽性急性淋巴細胞白血病(acute lymphoblastic leukemia, ALL)占成人急性淋巴細胞白血病總發病率的20%～30%。酪氨酸激酶抑制劑 (tyrosine kinase inhibitors, TKIs) 的問世顯著提高了Ph陽性(Ph+)ALL患者的療效[1-3]。然而，難治及復發是Ph+ALL患者面臨的主要問題。近年來，嵌合抗原受體修飾(chimeric antigen receptor, CAR)T細胞治療在難治/復發性急性B淋巴細胞白血病(B-ALL)中表現出前所未有的療效。TKIs可在體外及小鼠體內抑制CAR-T細胞的增殖和殺傷活性[4]，但臨床中TKIs與CD19 CAR-T細胞聯合應用，TKIs是否抑制后者的功能而影響療效，目前尚不清楚。本研究利用CD19 CAR-T細胞治療難治/復發Ph+ALL，同時給予TKIs口服，研究TKIs是否會影響CD19 CAR-T細胞的擴增、療效及不良反應。

1 資料與方法

1.1病例選擇 收集2018年4月至2019年10月在我院確診的10例難治/復發Ph+ALL患者及16例難治/復發Ph陰性B-ALL患者，根據是否添加TKIs分為兩組，TKIs組10例，男7例，女3例，中位年齡54(33，66)歲，臨床資料見表1；非TKIs組16例，男9例，女7例，中位年齡27(15，50)歲。研究經我院倫理委員會批準，標本的采集經所有研究對象知情同意并簽署知情同意書，以難治/復發B-ALL入組我院“人源化CD19 CAR-T治療復發/難治B細胞淋巴瘤/急性B淋巴細胞白血病”臨床試驗(ChiCTR1800019622)。

表1 10例難治/復發Ph+ ALL患者的臨床特征

1.2收集臨床資料 包括性別、年齡、輸注CAR-T細胞時外周血白細胞數和流式骨髓原始細胞比例、免疫分型、細胞遺傳學標志、BCR/ABL激酶類型、服用TKIs種類、BCR/ABL激酶區突變類型、造血干細胞移植情況及中樞神經系統受累情況等。

1.3CD19 CAR-T細胞制備及輸注 收集患者的單采外周血，使用淋巴細胞分離液提取外周血單個核細胞，使用磁珠分選試劑盒從提取的單個核細胞中富集CD3+T細胞，并用CD3/CD28磁珠擴增CD3+T細胞，獲得的細胞用含有白細胞介素(IL)-2、谷氨酰胺的T細胞專用培養基培養。培養第4天使用流式細胞儀檢測培養體系中無CD19陽性白血病細胞殘留后，轉染含有抗CD19-CAR序列的慢病毒，培養第5天采用流式細胞儀檢測CD19 CAR-T細胞的轉染效率，培養第12天收獲CAR-T細胞。在輸注CD19 CAR-T細胞的前4天至前2天給予患者FC方案[F：氟達拉濱30 mg/(m2·d)，C：環磷酰胺300 mg/(m2·d)，共3天]進行淋巴細胞清除預處理， 然后輸注CD19 CAR-T細胞1×106/kg。

1.4TKIs口服治療 自外周血單個核細胞采集日起，TKIs組給予TKIs口服，其中伊馬替尼400 mg，1次/d；達沙替尼50～70 mg，2次/d；普納替尼45 mg，1次/d。

1.5CD19 CAR-T細胞的擴增 分別在CD19 CAR-T細胞輸注后第0天、4天、7天、14天、21天以及28天用流式細胞儀檢測兩組外周血中CD19 CAR-T細胞的比例。

1.6CD19 CAR-T細胞輸注的不良反應監測 分別在CD19 CAR-T細胞輸注后第0、4、7、14、21及28天用酶聯免疫吸附測定法(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測兩組外周血中細胞因子IL-6、IL-2R、IL-8、IL-10及腫瘤壞死因子α (TNF-α)水平。根據文獻分級標準[5]，進行細胞因子釋放綜合征(cytokine release syndrome, CRS)分級評定。

1.7療效評價 在CD19 CAR-T細胞輸注后14天評估治療反應，治療反應包括完全緩解(complete response, CR)、完全緩解伴血細胞不完全恢復(CR with incomplete count recovery, CRi)和無緩解(no remission, NR)。TKIs組于輸注CAR-T細胞后每月檢測BCR/ABL定量。本研究隨訪至2020年5月31日或患者死亡，比較兩組總生存率(overall survival, OS)和無病生存率(disease free survival, DFS)。

1.8統計學方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料以中位數(四分位數)[M (Q1，Q3)]表示，采用兩獨立樣本t檢驗；計數資料采用χ2檢驗或Fisher確切概率法；等級資料比較采用Mann-whitney秩和檢驗；采用Kaplan-Meier法計算OS和DFS，組間差異采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1臨床資料 與非TKIs組相比，TKIs組年齡更大，高危細胞遺傳學標志更多，但兩組在性別、輸注CAR-T細胞時外周血白細胞數和流式骨髓原始細胞比例、免疫分型、造血干細胞移植及中樞神經系統受累方面差異均無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 兩組臨床特征比較

2.2CD19 CAR-T細胞的轉染率和輸注情況 TKIs組和非TKIs組CD19 CAR-T細胞的轉染率均值分別為55.96%和57.43%，差異無統計學意義(t=1.518，P=0.269)。TKIs組和非TKIs組輸注CD19 CAR-T細胞的均值分別為(1.08±0.02)×106/kg和(1.10±0.03)×106/kg，差異無統計學意義(t=0.957，P=0.328)。

2.3CD19 CAR-T細胞擴增情況 兩組外周血中CD19 CAR-T細胞峰值均出現在輸注后第7～14天，在輸注14天以后逐漸下降。TKIs組外周血中CD19 CAR-T細胞峰值為41.80%(25.19%, 65.14%)，非TKIs組外周血中CD19 CAR-T細胞峰值為14.80%(3.32%, 33.74%)，差異有統計學意義(t=3.220，P=0.0037), 見圖1。

2.4兩組細胞因子比較 兩組細胞因子在輸注CD19 CAR-T細胞后第4～14天升至峰值，第14天以后逐漸下降。兩組細胞因子峰值差異均無統計學意義，見圖2。

2.5兩組不良反應比較 TKIs組CRS為1～4級，其中1級30%(3/10)，2級30%(3/10)，3級30%(3/10)，4級10%(1/10)。非TKIs組CRS為1～3級，其中1級62.5%(10/16)，2級18.75%(3/16)，3級18.75%(3/16)，差異無統計學意義(P=0.135)，見圖3。

2.6隨訪及療效觀察短期療效 TKIs組CD19 CAR-T治療后第14天均達CR/CRi；非TKIs在CD19 CAR-T治療后第14天，CR率為75%(12/16)，NR率為25%(4/16)，差異無統計學意義(P=0.136)。TKIs組在輸注后1個月BCR/ABL融合基因定量均為0。遠期療效：非TKIs組有5例患者行異基因造血干細胞移植(hematopoietic stem cell transplantation, HSCT)。至隨訪截止日期，中位隨訪時間為8個月，TKIs組中位OS時間為10.0個月，非TKIs未移植組中位OS時間為6.0個月，非TKIs

移植組尚未獲得中位OS，差異無統計學意義(χ2=1.746；P=0.418)。TKIs組中位DFS時間為8.0個月，非TKIs未移植組中位DFS時間為4.0個月，非TKIs移植組尚未獲得中位DFS，差異無統計學意義(χ2=1.644；P=0.440)，見圖4。

3 討 論

在TKIs問世以前，Ph+ALL患者易復發、緩解期短、預后差。隨著TKIs的應用，Ph+ALL的療效顯著提升。然而，難治/復發仍是Ph+ALL亟待解決的關鍵問題。TOGASAKI等報道發現，HSCT能顯著降低Ph+ALL復發率[6]。當前，對于難治/復發Ph+ALL患者，異基因HSCT仍是首選治療方式。然而，由于高齡或缺乏供者，部分患者沒有條件進行異基因HSCT。

CAR-T細胞是通過基因工程改造的T淋巴細胞，能特異性識別并殺傷腫瘤細胞[7]。CAR-T治療使B-ALL的療效大大改善， 其中CD19 CAR-T在成人及兒童難治復發性CD19+ALL的完全緩解率在70%～90%[8-12]。因此，CAR-T是沒有移植條件的難治/復發Ph+ALL患者的新的治療選擇。本研究收集了10例難治/復發Ph+ALL患者的臨床資料，其中8例患者因高齡或缺乏供者無法行異基因HSCT， 另2例患者行異基因HSCT后復發，故10例患者均選擇CD19 CAR-T治療，同時給予TKIs口服。

研究表明，TKIs達沙替尼在體外及小鼠體內能抑制CAR-T細胞的擴增和殺傷活性，去除達沙替尼后，CAR-T細胞的增殖和殺傷活性可以恢復，因此達沙替尼對CAR-T細胞起到“開關”的作用[4]。在臨床實踐中，選擇CD19 CAR-T治療的Ph+ALL患者一般會常規服用TKIs，但TKIs是否抑制人體內CD19 CAR-T的功能及療效，目前尚不清楚。本研究首次表明TKIs可以促進CD19 CAR-T細胞在復發Ph+ALL中的擴增。盡管與非TKIs組相比，TKIs組年齡更大，高危細胞遺傳學標志更多，但兩組OS和DFS均差異無統計學意義，兩組CRS分級和細胞因子分泌水平差異無統計學意義，表明TKIs既不抑制CAR-T的療效，也不加重其不良反應。

在短期療效方面，盡管TKIs組與非TKIs組差異無統計學意義，但TKIs組 CR率整體要高于非TKIs組。因此服用TKIs能在短期內提高療效，與非TKIs組相比，統計學上的無差異可能是入組病例數較少的緣故。

此外，本研究結果與此前報道的TKIs在體外及小鼠體內實驗結果完全相反， 這可能是由于體內外及不同物種之間環境差異造成的。CAR-T細胞在體內的藥代動力學取決于多種內在和外在因素，如CAR-T產物表型和成分、腫瘤負荷、輸注前的淋巴消耗治療等。此外，不同來源的CAR-T細胞的功能活性不同，達到同一輸注效果所需的CAR-T數量不同[12-13]。小鼠與患者以上這些因素的差異及體內外環境的不同可能導致研究結果的不同。

綜上所述，本研究首次表明，TKIs促進CD19 CAR-T細胞在復發Ph+ALL中的擴增，不抑制CD19 CAR-T細胞的療效，不加重其不良反應。CD19 CAR-T聯合TKIs是沒有條件行異基因HSCT的復發Ph+ALL的新的選擇，其療效顯著，安全性好。