非小細胞肺癌罕見驅動基因突變特點及其與臨床病理特征的相關性

王 也，楊 磊，于 芳，姜睿盈，王 蓓，趙 玲，陳 皇，王曉偉，鐘定榮

（中日友好醫院 病理科，北京 100029）

肺癌是全世界發病和死亡率居于高位的惡性腫瘤[1]，其中絕大部分肺癌的病理類型為非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。目前，隨著各種驅動突變的發現以及相應靶向藥物的問世，使得非小細胞肺癌患者特別是晚期肺腺癌患者獲得了更多的治療方案。同時，檢測技術的不斷更新換代，也使一些罕見的驅動基因靶點慢慢進入了大家的視線，如ROS1、RET、HER2、PIK3CA 等。與之對應的靶向藥物也隨之進入臨床研究中，并取得了明顯的療效。NCCN（美國國立綜合癌癥網絡）指南中明確指出：在進行靶向藥物治療之前需要對基因突變的狀態進行檢測，以保證為患者提供更為精準的治療方案。其中多數驅動基因的突變可以通過熒光實時定量PCR（RT-PCR）的方法進行檢測[3]。本文通過回顧性收集630 例手術切除的非小細胞肺癌標本，使用RT-PCR 法檢測EGFR、ALK、ROS1、RET、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA 以及HER2 基因的突變情況，并對這些基因中的罕見突變或罕見突變位點進行總結分析。

1 對象與方法

1.1 研究對象

收集中日友好醫院病理科2018年11月～2019年12月期間送檢的非小細胞肺癌患者手術標本630 例。患者中男264 例（41.90%），女366例（58.10%）；年齡26～82 歲，平均59.72 歲，中位年齡61 歲。

組織學分型：原位腺癌9 例（1.43%）、微浸潤腺癌99 例（15.71%）、非黏液性浸潤性腺癌471例（74.76%）、黏液腺癌33 例（5.24%）、鱗癌14 例（2.22%）、大細胞癌4 例（0.63%）。

非黏液性浸潤性腺癌包括：附壁為主型80 例（16.99%）、腺泡為主型276 例（58.60%）、乳頭為主型62 例（13.16%）、實體為主型41 例（8.70%）以及微乳頭為主型12 例（2.55%）。

1.2 基因檢測方法

標本經過腫瘤含量評估后，切8～10μm 厚的石蠟卷5 片，裝入1.5ml EP 管中。脫蠟后，使用FFPE DNA/RNA 核酸共提取試劑盒（廈門艾德）進行DNA 和RNA 的提取。并用超微量紫外分光光度儀（日本島津）進行濃度測定。配制PCR 體系時，將DNA 濃度稀釋至2～3ng/μl，RNA 原始濃度上機。RT-PCR 使用擴增阻滯突變系統（amplification refractory mutation system，ARMS）法，試劑盒為5 種突變基因檢測試劑盒（廈門艾德）。實時定量PCR 儀為ABI 7500（美國）。PCR 程序：第一階段42°C 5min，95°C 5min，1 個循環；第二階段95°C 25s，64°C 20s，72°C 20s，10 個循環；第三階段93°C 25s，60°C 35s，72°C 20s，36 個循環。在第三階段60°C 時收集FAM 和VIC 熒光信號。結果參照試劑盒說明書進行判讀。

1.3 統計學方法

應用SPSS22.0 軟件進行統計學分析，相關性分析采用χ2檢驗或Fisher 精確檢驗以及Logistic回歸分析。腫瘤大小為單向等級有序資料，采用秩和檢驗。

2 結果

2.1 驅動突變檢測結果

熒光定量PCR 檢測結果見圖1～圖12（見封二），驅動基因突變時會出現相應的一條S 型擴增曲線（圖1～圖7），沒有突變時則沒有曲線（圖8）；融合基因檢測有內質控曲線一條（圖9～圖12中黑色曲線），發生融合時還有出現另一條擴增曲線（圖9～圖11中紅色曲線）。

圖1～圖7 RT-PCR基因突變擴增曲線，圖中S型曲線為驅動基因突變。圖1 EGFR18外顯子G719A/C/S伴21外顯子L861Q突變。圖2 EGFR20外顯子插入突變。圖3 KRAS外顯子2突變。圖4 NRAS外顯子3突變。圖5 BRAF突變。圖6 PIK3CA突變。圖7 HER突變。圖8 突變陰性病例。圖9～圖11 ALK、ROS1、RET融合基因擴增曲線。圖12 融合陰性病例。

EGFR、KRAS、NRAS、BRAF、PIK3CA、HER2、ALK、ROS1 和RET 總體的突變陽性率分別為51.11% 、7.94% 、0.16% 、0.63% 、0.48% 、3.49% 、3.49%、1.11%和1.75%。標本整體的突變陽性率為63.49%（400/630），融合陽性率為6.35%（40/630），全部野生型的病例占30.16%（190/630）。

罕見驅動基因改變占全部驅動基因改變的27.27%（120/440）。322 例EGFR 基因突變病例中出現常見敏感突變L858R 和19-del 共293 例（90.99%），G719X 或S768I 或L861Q 突變的病例18 例（5.59%），20-ins 突變12 例（3.73%） 以及T790M 突變1 例（0.31%，伴有L858R）。EGFR 罕見突變位點占9.63%（31/322）。

2.2 驅動基因共突變情況

L858R 與S768I、L858R 與T790M 共突變各1 例。EGFR 敏感性突變伴PIK3CA 突變2 例，其余檢測的驅動突變均未發生共突變情況。

2.3 驅動突變與臨床病理特點的相關性

12 例微乳頭為主型肺腺癌全部發生了驅動基因突變——包括EGFR 突變7 例，KRAS 突變2例，NRAS 突變1 例，HER2 突變1 例，RET 融合1例。33 例黏液腺癌中，出現EGFR 19-del 突變5例（其中1 例伴PIK3CA 突變），KRAS 突變10例，ALK 融合基因8 例。14 例鱗癌中見EGFR、KRAS、PIK3CA 突變各1 例。

表1 RAS、BRAF、PIK3CA、HER2 突變與臨床病理特征的相關性（n=630）

2.3.1 EGFR 基因罕見突變位點

EGFR 20-ins 突變在≤55 歲患者中的突變率（4.28%） 明顯高于＞55 歲的患者（0.93%）（P＞0.05），與年齡呈負相關（r=-0.108，P ＜0.05）。G719X、S768I、L861Q 以及T790M 突變與各項臨床病理信息之間的相關性不具有統計學意義（P＞0.05）。常見敏感突變（19-del 或L858R）與性別、腫瘤大小、組織學分型以及微乳頭成分之間的相關性具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3.2 RAS、BRAF、PIK3CA 與HER2 基因

表1示，HER2 基因在≤55 歲組（8.72%）、無微乳頭成分組（4.37%)、女性組（4.37%）的陽性率均高于＞55 歲組（1.15%）、有微乳頭成分組（1.16%） 和男性組（2.27%）。此外，全部22 例HER2 陽性病例，均發生在腫瘤最大徑≤3cm 組和無淋巴結轉移組。HER2 突變與患者年齡呈負相關（r=-0.191，P＜0.05）。RAS 基因突變在黏液腺癌中陽性率最高，可達30.30%（10/33），并與腫瘤大小呈正相關（r=0.159，P＜0.05），與性別及組織學分型的相關性具有統計學意義（P＜0.05）。PIK3CA與組織學分型之間的相關性具有統計學意義（P＜0.05）。

2.3.3 ALK、ROS1、RET 融合基因

表2示，ALK、ROS1、RET 基因融合均與組織學包含微乳頭成分呈正相關（r=0.097、0.105、0.136，P＜0.05）。ALK 基因融合與組織學分型的相關性具有統計學意義（P＜0.05），并與淋巴結轉移呈正相關（r=0.222，P＜0.05）。在實體為主型腺癌和黏液腺癌中的突變率分別為14.63%（6/41）和24.24%（8/33），二者的突變病例數占總突變病例數的63.64%（14/22）。

表2 ALK、ROS1、RET 融合與臨床病理特征的關系（n=630）

3 討論

3.1 罕見基因突變的臨床意義

EGFR 是非小細胞肺癌最為常見的基因突變類型，除19 外顯子缺失及21 外顯子L858R 突變是常見的敏感性突變[4]之外，還存在一些罕見突變類型，如G719X、S768I、L861Q 等敏感性突變，以及T790M、20 外顯子插入突變等與耐藥相關的突變[5]。罕見突變常常與其他敏感突變發生雙突變，這部分患者在接受靶向治療后可能療效低于單突變的患者[6]。

HER2 基因在非小細胞肺癌中的改變方式包括擴增、過表達以及突變。HER2 突變率為1.92%，在女性、未吸煙患者中常見[7]。有文獻報道HER2 突變的患者更容易從化療中獲益[8]。KRAS基因在白種人中突變率更高，在中國的突變率為5.9%～8.0%[9]。KRAS 通常與EGFR、BRAF 等基因突變互斥，與ALK 等基因融合亦不共存，并在實體為主型腺癌及浸潤性黏液腺癌中更為常見。PIK3CA 基因突變在肺腺癌中的陽性率為4.4%，文獻報告PIK3CA 基因可以和其他驅動突變發生共突變，這與我們的實驗結論一致。NRAS 基因突變較為少見，文獻報道其突變率為0.29%[10]，其臨床意義尚待探討。BRAF 基因在肺腺癌中的突變類型主要包括V600E、L956V、G468A 等，突變率約為4.9%，大部分突變類型為V600E 突變[11]。BRAF 抑制劑維莫非尼對BRAF V600E 突變的患者有一定的治療效果[12]。

3.2 ALK、ROS1、RET 基因融合的檢測意義

用于檢測基因融合的方法包括RT-PCR、熒光原位雜交、免疫組織化學和測序等，在臨床上以前兩者最為常見。ALK 基因融合常發生在實體型、腺泡型腺癌伴細胞內黏液的病理組織分型之中，突變率為6.6%～9.6%[13]。雖然ALK 融合的陽性率較低，但患者應用靶向藥物之后的客觀有效率明顯高于化療。ALK 基因融合一般與EGFR 等基因發生共突變的概率極低，但亦有文獻報道這2 個驅動基因可以同時發生突變[14]。與ALK 相似，ROS1 基因融合多見于女性不吸煙的肺腺癌患者，亦不與EGFR、KRAS、ALK 等驅動突變發生共存，其在人群中的總體發生率約為1%～2%[15]，目前針對ROS1 融合的靶向藥物包括克唑替尼以及卡博替尼等[16]。此外，ALK 與ROS1 基因融合都更容易出現在浸潤性黏液腺癌中。RET 基因融合發生率為1%～2%，NCCN 指南推薦使用卡博替尼來治療RET 融合的患者[16]。