miR-369-3p對缺氧誘導海馬神經元細胞增殖、凋亡的影響及其機制

呂喆，蔣曉剛，廉民學

1.西安大興醫院外科，陜西 西安 710082；2.西安交通大學醫學部生物化學與分子生物學系，陜西 西安 710061；3.西安交通大學第一附屬醫院神經外科，陜西 西安 710061

阿爾茨海默癥(Alzheimer's disease，AD)是一種進行性中樞神經系統退行性疾病，目前尚未有完全治愈的方法，神經元細胞凋亡是其主要病理特征之一[1]。因此，尋找可抑制神經元細胞凋亡的藥物及治療方式對AD的及早預防和治療具有重要意義。研究AD的發病機制，以相應的病理因素為靶點，開發具有新藥理活性的藥物是目前治療AD的研究熱點[2]。MicroRNA(miRNA)是一類內源性非編碼小RNA，其可通過調控靶基因的表達參與細胞的凋亡過程，且在AD的發生、發展過程中發揮重要作用[3]。有研究發現上調miR-369可以靶向下調SOX4抑制骨肉瘤細胞增殖并誘導細胞凋亡[4]。miR-369-3p通過干擾血管內皮細胞生長因子C(vascular endothelial growth factor C，VEGFC)基因的表達可抑制膀胱癌細胞的增殖，促進膀胱癌細胞的凋亡[5]。miR-369-3p在過氧化氫刺激的海馬神經元細胞中顯著上調表達[6]。酰胺磷酸核糖轉移酶(nicotinamide phosphoribosyltransferase，NAMPT)是一種由脂肪細胞分泌的細胞因子，一個重要的神經保護因子，可能參與腦疾病的發生[7]。NAMPT還是煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)合成的限速酶，其可能通過控制細胞和機體的NAD水平，從而影響細胞中活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的產生以及抗氧化酶的表達，進而影響衰老進程或促進AD形成[8]。然而miR-369-3p、NAMPT對缺氧誘導的海馬神經元細胞凋亡的影響及其機制尚不清楚。本實驗用缺氧處理海馬神經元細胞建立缺氧損傷模型，研究miR-369-3p對缺氧誘導海馬神經元細胞凋亡的影響及其機制是否與NAMPT有關，以期為AD的病理研究提供一定的理論依據和為AD的治療提供靶點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 DMEM培養基、胎牛血清、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibico公司；神經元特異性烯醇化酶(neuron specific enolase，NSE)多克隆抗體和SP免疫組化試劑盒(即用型)購自北京中山生物技術有限公司；Trizol試劑、熒光定量試劑盒購自上海莼試生物技術有限公司；四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT)試劑盒購自上海聯碩生物科技有限公司；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和碘化丙錠(PI)試劑盒購自上海經科化學科技有限公司；二辛可寧酸(BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自北京百奧萊博科技有限公司；Bax、Bcl-2、Cyclin D1、P21、NAMPT、GAPDH多克隆抗體和山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)購自北京博奧森生物科技有限公司；超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)試劑盒購自上海茁彩生物科技有限公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自武漢純度生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 海馬神經元細胞Hhn分離培養與鑒定 參考趙秀鶴等[9]研究方法，取12～20周齡引產的胎兒，常規消毒后開顱，分離雙側海馬，置于DMEM培養液中，剔除血管和腦膜組織，剪碎，加入0.125%的胰酶，消化完全，800 r/min離心5 min，去上清，加入DMEM培養液再次離心去上清，再加入DMEM培養液重懸，在37℃、5%CO2條件下培養，隔天換液一次，每天在顯微鏡下觀察神經元生長情況，培養7～14 d時海馬神經元胞體飽滿，呈橢圓形或多邊形，樹突發達，相互交錯；培養10 d后用NSE多克隆抗體進行免疫組化實驗，神經元細胞會被染成棕色，此時期大部分細胞均被染色，說明多為神經元細胞，取這一時期的細胞用于實驗。

1.2.2 細胞缺氧處理與分組 將Hhn細胞用無血清低糖的DMEM培養基培養，置于持續充入95%N2+5%CO2的密閉培養箱中進行缺氧處理48 h，作為缺氧組，正常培養的細胞作為對照組。取對數生長期細胞Hhn，培養24 h后更換培養基，將miR-NC、miR-369-3p、anti-miR-NC、anti-miR-369-3p分別轉染至Hhn細胞中，分別記為miR-NC組、miR-369-3p組、anti-miR-NC組、anti-miR-369-3p組；將anti-miR-NC、anti-miR-369-3p、pcDNA3.1、pcDNA3.1-NAMPT 分別轉染至Hhn細胞中再進行缺氧處理，分別記為缺氧+anti-miR-NC組、缺氧+anti-miR-369-3p組、缺氧+pcDNA3.1組、缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組；將anti-miR-369-3p質粒分別與si-NC、si-NAMPT共轉染至Hhn細胞中再進行缺氧處理，分別記為缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組、缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組。轉染按照LipofectamineTM2000試劑盒進行操作。

1.2.3 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)檢測miR-369-3p表達水平 提取細胞總RNA，反轉錄成cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR擴增，miR-369-3p以U6為內參，miR-369-3p正向引物序列：5'-CTCCTGGTACCTGAAGGGAGA-3'，反向引物序列：5'-CTCCAAGGTGAGATTTGATACTGA-3'；U6正向引物序列為：5'-CGCTTCGGCACATATAC-3'，反向引物序列為：5'-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3'。反應條件：95℃變性 30 s，60℃退火 30 s；72℃延伸 30 s，共 40 個循環。相對表達量采用2-△△Ct法計算。

1.2.4 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集細胞，漂洗后用結合緩沖液重懸，加入Annexin V-FITC和PI，避光孵育，上流式細胞儀進行檢測。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.5 蛋白質印跡(Western blot)檢測CyclinD1、P21、Bcl-2、Bax和NAMPT蛋白表達水平 提取細胞總蛋白，BCA法進行定量，電泳、轉膜至PVDF，封閉2 h，加入一抗4℃孵育過夜；加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，Quantity One軟件測各條帶灰度值，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白相對表達水平。

1.2.6 MTT檢測細胞增殖活性 取分別培養24 h、48 h、72 h的細胞，加入20μL的MTT溶液，繼續培養4 h；吸去培養液后加150μL的DMSO，振蕩10 min，檢測490 nm處吸光度(OD)值。細胞增殖活性(%)=實驗組OD值/空白對照組OD值×100%。實驗重復3次，每次設3個復孔。

1.2.7 SOD和MDA試劑盒分別檢測SOD活性和MDA含量 收集細胞磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗3遍，消化，吹打，800 r/min離心10 min得細胞沉淀；PBS再洗3遍，加0.5 mL PBS吹打均勻，超聲10 min使細胞裂解，40 r/min離心10 min取上清液，用于SOD活性和MDA含量檢測，具體步驟分別按照SOD和MDA試劑盒進行。

1.2.8 雙熒光素酶報告 實驗檢測miRR-369R-3p對NAMPT的靶向調控TargetScan預測顯示NAMPT 3'UTR區域有miR-369-3p的結合位點。構建含miR-369-3p的結合位點的NAMPT 3'UTR野生型和突變型熒光素酶表達載體WT-NAMPT和MUT-NAMPT，將其分別與miR-NC和miR-369-3p共轉染至Hhn細胞中。按照說明書操作進行，檢測熒光活性，實驗重復3次。

1.3 統計學方法 應用SPSS20.00統計軟件分析實驗數據，計量資料符合正態分布，以均數±標準差(±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩間比較采用t檢驗，以P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導的細胞Hhn中的表達 與對照組相比，缺氧組Hhn細胞中miR-369-3p表達水平顯著升高，NAMPT表達水平明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1和表1。

圖1 NAMPT在缺氧誘導的細胞Hhn中的表達

表1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導的細胞Hhn中的表達(±s，n=9)

表1 miR-369-3p、NAMPT在缺氧誘導的細胞Hhn中的表達(±s，n=9)

對照組缺氧組t值P值0.36±0.03 0.87±0.09 16.128＜0.05 0.59±0.06 0.20±0.02 18.499＜0.05

2.2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA的影響 與對照組相比，缺氧組Hhn細胞中miR-369-3p、P21、Bax表達水平明顯升高，Cyclin D1、Bcl-2表達水平明顯降低，細胞活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)；與缺氧+anti-miR-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p組Hhn細胞中miR-369-3p、P21、Bax表達水平明顯降低，Cyclin D1、Bcl-2表達水平明顯升高，細胞活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖2、表2和表3。

圖2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡的影響

表2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表2 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別miR-369-3p Cyclin D1 P21細胞活性(490 nm)對照組缺氧組缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組F值P值0.34±0.03 0.86±0.09a 0.83±0.08 0.45±0.04b 147.529＜0.05 0.85±0.08 0.20±0.02a 0.22±0.02 0.70±0.07b 327.942＜0.05 0.31±0.03 0.82±0.08a 0.84±0.08 0.38±0.03b 195.514＜0.05 24 h 0.56±0.05 0.23±0.02a 0.22±0.02 0.44±0.04b 202.959＜0.05 48 h 0.98±0.09 0.35±0.03a 0.34±0.03 0.79±0.08b 228.000＜0.05 72 h 1.63±0.16 0.54±0.05a 0.55±0.05 1.23±0.12b 230.207＜0.05

表3 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表3 抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

注：與對照組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別對照組缺氧組缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組F值P值凋亡率(%)7.11±0.75 25.61±2.63a 24.58±2.51 12.39±1.36b 191.903＜0.05 SOD活性101±10.27 38.56±3.92a 37.22±3.81 70.29±7.36b 174.309＜0.05 MDA含量100.21±10.34 296±22.98a 288±22.51 165±12.37b 255.191＜0.05 Bax 0.14±0.01 0.85±0.08a 0.82±0.08 0.31±0.03b 336.522＜0.05 Bcl-2 0.94±0.09 0.23±0.02a 0.24±0.02 0.76±0.07b 343.022＜0.05

2.3 miR-369-3p靶向、調控NAMPT的表達 TargetScan在線軟件預測顯示NAMPT與miR-369-3p存在結合位點(圖3A)。雙熒光素酶報告實驗結果(表4)顯示，相較于miR-NC組，miR-369-3p組轉染野生型NAMPT載體的細胞Hhn熒光素酶活性明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)；而轉染突變型NAMPT載體的細胞Hhn熒光素酶活性差異無統計學意義(P＞0.05)。相較于miR-NC組，miR-369-3p組NAMPT表達水平明顯降低；相較于anti-miR-NC組，anti-miR-369-3p組NAMPT表達水平明顯升高，差異具有統計學意義(P＜0.05)，見圖3B和表5。

2.4 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA表達的影響 與缺氧+pcDNA3.1組相比，缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組Hhn細胞中P21、Bax表達水平明顯降低，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達水平明顯升高，細胞活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4、表6和表7。

圖3 miR-369-3p靶向、調控NAMPT

表4 雙熒光素酶報告實驗(±s，n=9)

表4 雙熒光素酶報告實驗(±s，n=9)

組別miR-NC組miR-369-3p組t值P值WT-NAMPT 1.06±0.10 0.41±0.04 18.105＜0.05 MUT-NAMPT 1.02±0.10 0.98±0.10 0.849 0.409

表5 miR-369-3p調控NAMPT的表達(±s，n=9)

表5 miR-369-3p調控NAMPT的表達(±s，n=9)

注：與miR-NC組比較，a P＜0.05；與anti-miR-NC組比較，b P＜0.05。

組別miR-NC組miR-369-3p組anti-miR-NC組anti-miR-369-3p組F值P值NAMPT 0.53±0.05 0.21±0.02a 0.54±0.05 0.82±0.08b 189.661＜0.05

2.5 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡及SOD、MDA表達的影響 與缺氧+anti-miR-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p組Hhn細胞中P21、Bax表達水平明顯降低，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達水平明顯升高，細胞活性明顯升高，細胞凋亡率明顯降低，SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異均具有統計學意義(P＜0.05)；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組相比，缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組Hhn細胞中p21、Bax表達水平明顯升高，NAMPT、Cyclin D1、Bcl-2表達水平明顯降低，細胞活性明顯降低，細胞凋亡率明顯升高，SOD活性明顯降低，MDA含量明顯升高，差異均具有統計學意義(P＜0.05)，見圖5、表8和表9。

圖4 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡蛋白表達的影響

表6 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表6 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

組別NAMPT Cyclin D1 P21細胞活性(490 nm)缺氧+pcDNA3.1組缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組t值P值0.21±0.02 0.48±0.05 15.041＜0.05 0.22±0.02 0.62±0.06 18.974＜0.05 0.84±0.08 0.45±0.04 13.081＜0.05 24 h 0.22±0.02 0.41±0.04 12.746＜0.05 48 h 0.34±0.03 0.66±0.06 14.311＜0.05 72 h 0.55±0.05 1.14±0.12 13.615＜0.05

表7 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表7 過表達NAMPT對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

組別缺氧+pcDNA3.1組缺氧+pcDNA3.1-NAMPT組t值P值SOD活性37.22±3.81 63.25±6.36 10.533＜0.05 MDA含量288±22.51 184±15.47 11.423＜0.05 Bax 0.82±0.08 0.46±0.04 12.085＜0.05 Bcl-2 0.24±0.02 0.60±0.06 17.076＜0.05凋亡率(%)24.58±2.51 14.12±1.51 10.713＜0.05

表8 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

表8 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖的影響(±s，n=9)

注：與缺氧+anti-miR-NC組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組比較，b P＜0.05。

組別NAMPT Cyclin D1 P21細胞活性(490 nm)缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組F值P值0.23±0.02 0.52±0.05a 0.51±0.05 0.30±0.03b 123.810＜0.05 0.22±0.02 0.70±0.07a 0.72±0.07 0.28±0.03b 230.919＜0.05 0.84±0.08 0.38±0.03a 0.36±0.03 0.68±0.07b 151.237＜0.05 24 h 0.22±0.02 0.44±0.04a 0.45±0.04 0.26±0.02b 128.625＜0.05 48 h 0.34±0.03 0.79±0.08a 0.81±0.08 0.42±0.04b 141.020＜0.05 72 h 0.55±0.05 1.23±0.12a 1.26±0.12 0.73±0.07b 126.854＜0.05

表9 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

表9 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn凋亡及SOD、MDA的影響(±s，n=9)

注：與缺氧+anti-miR-NC組比較，a P＜0.05；與缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組比較，b P＜0.05。

組別缺氧+anti-miR-NC組缺氧+anti-miR-369-3p組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NC組缺氧+anti-miR-369-3p+si-NAMPT組F值P值凋亡率(%)24.58±2.51 12.39±1.36a 12.20±1.31 18.68±1.88b 93.639＜0.05 SOD活性37.22±3.81 70.29±7.36a 71.25±7.40 45.67±4.73b 73.745＜0.05 MDA含量288±22.51 165±12.37a 162±13.01 225±19.63b 105.126＜0.05 Bax 0.82±0.08 0.31±0.03a 0.30±0.03 0.66±0.06b 205.500＜0.05 Bcl-2 0.24±0.02 0.76±0.07a 0.78±0.07 0.33±0.03b 258.892＜0.05

圖5 抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖、凋亡蛋白表達的影響

3 討論

AD發病機制復雜，氧化應激是其發生的重要因素之一[10]。有研究發現AD患者的海馬組織中神經元凋亡率明顯較高[11]；說明海馬神經元細胞凋亡與AD的發生有關。而缺氧可誘導大鼠海馬神經元凋亡[12]。因此，本實驗缺氧處理細胞Hhn建立AD細胞模型，結果顯示，細胞凋亡率升高，細胞活性降低，超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性降低，丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量升高；說明缺氧可誘導Hhn細胞凋亡和氧化應激的產生，從而導致Hhn細胞損傷；AD細胞模型成功建立。

研究表明miRNA與AD的進展密切相關，藥物的靶向治療策略是AD的新治療策略，miRNA可作為AD新型藥物研發的靶點[13]。有研究報道AD患者中miR-369-3p表達水平增加，miR-369-3p可能與AD的發生發展有關[14]。研究報道抑制miR-369-3p表達可抑制細胞活力，促進放射誘導的細胞凋亡[15]。本實驗結果顯示，在缺氧處理的細胞Hhn中miR-369-3p高表達，抑制miR-369-3p表達可提高CyclinD1、Bcl-2表達水平，降低p21、Bax表達水平，降低細胞凋亡率，提高細胞活性，降低SOD活性，提高MDA含量。說明抑制miR-369-3p表達可抑制缺氧誘導的Hhn細胞凋亡和氧化應激反應，保護缺氧誘導的Hhn細胞損傷。

NAMPT參與NAD的合成，與神經退行性疾病以及心腦血管疾病密切相關[16]。有研究報道老年小鼠腦缺血情況下NAD水平明顯降低，補充NAD對腦缺血具有保護作用[17]。此外，研究報道上調NAMPT可提高SAMP8小鼠的認知功能[18]。以上研究表明NAMPT可能參與腦部疾病的進展過程，但其對缺氧處理的神經元損傷的影響還尚不清楚。本實驗結果顯示，在缺氧處理的細胞Hhn中NAMPT低表達，過表達NAMPT可提高CyclinD1、Bcl-2表達水平，降低p21、Bax表達水平，降低細胞凋亡率，提高細胞活性，降低SOD活性，提高MDA含量。說明過表達NAMPT可抑制細胞凋亡和氧化應激反應，保護缺氧誘導的Hhn細胞損傷。此外，本實驗還發現miR-369-3p靶向調控NAMPT；而抑制NAMPT表達能逆轉抑制miR-369-3p對缺氧誘導的細胞Hhn增殖促進、凋亡抑制及提高SOD活性、降低MDA含量的作用。提示，miR-369-3p可能通過調控NAMPT影響缺氧誘導的細胞Hhn損傷。

綜上所述，抑制miR-369-3p表達可促進缺氧誘導的海馬神經元細胞增殖，抑制細胞凋亡，減輕氧化應激反應，即可保護缺氧誘導的海馬神經元細胞損傷，其機制可能與NAMPT相關，將可為阿爾茲海默癥的防治提供新思路和新靶點。