丹參酮ⅡA聯合三氧化二砷對人白血病細胞株NB4體外凋亡、自噬的影響及其機制

王叨，張永卓，陳嬌，游紅亮，丁艷杰，魏林林，徐巖，劉玉峰

(1.鄭州大學第一附屬醫院 兒內科，河南 鄭州 450052；2.濮陽市人民醫院 兒內科，河南 濮陽 457000)

丹參酮ⅡA(tanshinone ⅡA，Tan ⅡA)是從丹參中分離出的二萜醌類化合物，臨床主要用來治療心血管疾病和缺血性腦卒中。近年來研究發現，Tan ⅡA不僅對多種腫瘤細胞有抗增殖活性，還可協同增強多種化療藥物的抗腫瘤活性[1-4]，但其作用的具體分子機制尚不十分清楚。本研究以人急性早幼粒細胞白血病細胞株NB4為研究對象，擬從細胞凋亡和自噬角度，探討Tan ⅡA聯合三氧化二砷(arsenic trioxide，ATO)體外對白血病細胞增殖的影響及其可能的分子機制，為臨床采用Tan ⅡA輔助治療白血病提供基礎實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料所用NB4細胞來自鄭州大學第一附屬醫院細胞室，Tan ⅡA來自中國藥品生物制品檢定所，流式細胞儀來自美國Becton Dickinson公司，1 g·L-1亞砷酸注射液來自哈爾濱伊達制藥廠，CCK-8試劑盒來自日本Dojindo公司，Annexin V-FITC/PI Apoptosis Detection Kit來自南京凱基生物科技有限公司，單丹磺酰尸胺(monodansylcadaverin，MDC)來自美國Sigma公司，兔抗人Beclin 1抗體、兔抗人微管相關蛋白1輕鏈3(LC3)-Ⅱ抗體、鼠抗人actin抗體、小鼠抗人半胱天冬酶-3(Caspase-3)抗體均來自美國Sigma公司，BCA蛋白檢測試劑盒來自上海碧云天生物技術有限公司。本研究經鄭州大學第一附屬醫院醫學倫理委員會審批通過。

1.2 實驗方法

1.2.1細胞培養及分組 NB4細胞接種于含體積分數10%的胎牛血清、105U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的RPMI 1640培養基常規傳代培養。取對數生長期細胞進行實驗，共分6組：4、8、16 mg·L-1Tan ⅡA組，0.5 mg·L-1ATO組，8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO組，對照組加入9 g·L-1生理鹽水。

1.2.3流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測細胞凋亡率 收集藥物處理48 h后的細胞1×106個，磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)洗滌后，重懸于500 L緩沖液，分別加入5 L Annexin-V-FITC、5 L碘化丙啶(propidium iodide，PI)，混勻，室溫避光15 min，PBS洗滌后上機檢測。

1.2.4FCM法檢測細胞自噬小體率 收集藥物處理48 h后的細胞1×106個，PBS洗滌后，重懸于500 L緩沖液，加入0.05 mmol·L-1的MDC染液100 L，混勻，室溫避光15 min，PBS洗后上機檢測。

1.2.5蛋白質印跡法檢測Caspase-3、Beclin-1、LC3-Ⅱ 收集藥物處理48 h后的各組細胞，加入細胞裂解液，混勻后冰上裂解40 min，離心收集上清液，BCA法檢測蛋白濃度。以50 g總蛋白進行SDS-PAGE后轉膜至PVDF膜，50 g·L-1脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，次日洗滌后加入相應二抗孵育2 h，洗滌后進行X線膠片顯影。

2 結果

2.1 細胞增殖活力MTT法檢測結果顯示，隨著Tan ⅡA作用時間的延長和質量濃度的增加，NB4細胞增殖抑制率呈上升趨勢，差異有統計學意義(F=65.093，P=0.023)，說明Tan ⅡA對NB4細胞增殖有抑制作用，且呈一定的劑量和時間依賴性。在同一時間點上，聯合用藥組細胞的增殖抑制率大于同劑量單藥組(均P<0.05)。見表1。

表1 MTT法檢測各組NB4細胞增殖抑制率

2.2 NB4細胞凋亡率藥物作用48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組細胞凋亡率分別為(11.28±3.32)%、(32.69±5.60)%，均高于對照組的(2.81±0.93)%，差異有統計學意義(t1=4.253，P1=0.025；t2=9.110，P2=0.001)。聯合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞凋亡率為(44.02±6.47)%，高于單藥組(t1=8.235，P1=0.027；t2=13.790，P2=0.005)。見圖1。

圖1 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞凋亡的影響

2.3 NB4細胞自噬小體率藥物作用48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組細胞的自噬小體率分別為(18.42±7.63)%、(34.36±7.60)%，均高于對照組的(5.07±1.62)%，差異有統計學意義(t1=7.953，P1=0.006；t2=6.773，P2=0.004)。聯合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞自噬小體率為(53.26±7.39)%，高于單藥組(t1=6.367，P1=0.001；t2=9.471，P2=0.037)。見圖2。

圖2 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞自噬的影響

2.4 凋亡特異蛋白Caspase-3表達水平蛋白質印跡法檢測結果顯示，藥物處理48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組的NB4細胞內Caspase-3相對表達量較對照組高(t1=8.030，P1=0.003；t2=12.246，P2=0.002)。兩藥聯合組(8 mg·L-1Tan ⅡA+0.5 mg·L-1ATO)細胞內Caspase-3相對表達量高于8 mg·L-1Tan ⅡA組和0.5 mg·L-1ATO組(t1=19.575，P1=0.005；t2=4.067，P2=0.036)。見圖3。

圖3 Tan ⅡA、ATO對NB4細胞內Caspase-3表達的影響

2.5 自噬相關蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ表達水平蛋白質印跡法檢測結果顯示，藥物處理48 h后，8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組NB4細胞內蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量均高于對照組(t1=3.761，P1=0.039；t2=6.840，P2=0.001)。兩藥聯合組NB4細胞內Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量高于8 mg·L-1Tan ⅡA組、0.5 mg·L-1ATO組(t1=9.423，P1=0.003；t2=7.568，P2=0.013)。見圖4。

圖4 NB4細胞內自噬特異性蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ的相對表達量

3 討論

本實驗以3種不同質量濃度的Tan ⅡA與急性早幼粒白血病NB4細胞共同培養， MTT檢測結果顯示，隨著藥物質量濃度的提高和作用時間的延長，NB4細胞活力呈下降趨勢，表明本實驗質量濃度范圍內的Tan ⅡA對NB4細胞增殖有抑制作用，且呈一定的時間和劑量相關性。Tan ⅡA聯合ATO組NB4細胞的增殖抑制率大于單藥組，與部分文獻報道[5-7]一致，表明Tan ⅡA可協同增強ATO的抗白血病細胞增殖活性，提示Tan ⅡA可作為增強ATO化療效果的輔助藥物，但其具體分子作用機制和作用靶點尚不完全清楚。

自噬和凋亡是兩種主要的細胞程序性死亡方式，雖然生化代謝途徑及形態學存在差異，但功能密切聯系，共同調控細胞生存和死亡[8]，因而成為多種抗腫瘤藥物的作用靶點。本研究團隊推測Tan ⅡA對ATO抗白血病化療的增敏作用機制可能與凋亡和自噬有關。

Tan ⅡA和ATO處理NB4細胞48 h后，經FCM檢測發現，Tan ⅡA、ATO單藥均可誘導NB4細胞凋亡，兩藥聯合組細胞凋亡率大于單藥組，提示促進細胞凋亡是Tan ⅡA協同ATO抗白血病的作用機制之一。Caspase-3是Caspase家族蛋白中凋亡效應蛋白酶，是凋亡的終末執行器[9]。本研究蛋白質印跡法檢測結果顯示，Tan ⅡA和ATO聯合用藥組細胞Caspase-3表達量高于單藥組和對照組，提示上調Caspase-3表達是Tan ⅡA協同ATO誘導NB4細胞凋亡的分子機制之一。

自噬是細胞利用溶酶體降解自身受損的細胞器和大分子物質的過程，對細胞的存活和死亡起著舉足輕重的作用。自噬既可以作為一種防御機制清除細胞質內受損的細胞器和大分子物質，保護受損的細胞，同時還可作為一種Ⅱ型程序性死亡方式誘導細胞主動性死亡[10-11]，即自噬性細胞死亡。在自噬過程中，自噬溶酶小體的形成是關鍵[12]。本研究經FCM檢測發現，Tan ⅡA可協同增強ATO誘發的細胞自噬活性。因此，本研究團隊認為Tan ⅡA協同ATO抗白血病化療增敏機制也與增強NB4細胞自噬活性、誘發細胞自噬性死亡有關。

自噬是一個受基因嚴格調控的程序性過程，涉及一系列自噬相關蛋白，其中的核心自噬特異蛋白包括Beclin-1、LC3。Beclin-1可與Barkor/Atg14(L)、hVps15、Class Ⅲ PI3K/hVps34相互結合組成一個特異性PI3K復合物[13-15]，調控自噬前體和自噬體的形成和成熟。自噬啟動后，LC3被裂解為LC3-Ⅱ，后者與自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，PE)共價結合形成脂化的LC3-Ⅱ-PE復合物[14]，參與自噬泡和自噬小體內外膜的延伸，其水平的高低可反映細胞自噬水平。本研究通過蛋白質印跡法檢測發現，Tan ⅡA和ATO聯合用藥組NB4細胞內的自噬特異蛋白Beclin-1和LC3-Ⅱ的相對表達量高于單藥組和對照組，說明Tan ⅡA協同ATO增強NB4細胞自噬活性的機制與其促進自噬特異蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ高表達有關。有研究報道Tan ⅡA可誘導人口腔鱗狀細胞癌SCC-9細胞自噬性死亡并伴有Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的高表達[16]。結合文獻報道，本研究團隊認為Tan ⅡA可協同ATO促進Beclin-1、LC3-Ⅱ高表達，增強NB4細胞自噬活性，誘導自噬性死亡，從而發揮化療增敏效果。

本實驗證實，Tan ⅡA在體外有抑制人急性早幼粒白血病NB4細胞株增殖的作用，并對ATO有化療增敏作用，其機制可能與上調自噬特異性蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ及凋亡特異性蛋白Caspase-3的表達有關，通過誘導自噬性死亡和凋亡共同促進細胞死亡，但具體的分子機制和調控機制仍有待進一步研究闡明。Tan ⅡA有望成為一種有前途的、高效低毒的抗腫瘤增敏藥物，為白血病的治療提供新的策略。