37 家實驗室新型冠狀病毒核酸檢測室間質評結果分析

姜青龍，曾黎峰，李勝遠，王征勇，李蓉

（1.江西省臨床檢驗中心，江西 南昌330006； 2.江西省人民醫院檢驗科，江西 南昌330006）

為加強江西省新型冠狀病毒（2019 novel coronavirus，2019-nCoV）核酸檢測的質量管理，驗證各實驗室的檢測能力,保證檢測結果的準確性和可比性, 對37 家臨床基因檢測實驗室進行一次2019-nCoV 核酸檢測室間質評活動。

1 材料與方法

1.1 標本來源 廣州邦德盛生物科技有限公司（江西萬點生物技術有限公司惠贈),每家實驗室發放5個批號,即：202011,202012,202013,202014,202015;所有質控物為假病毒，均冷鏈運輸（江西樂成生物科技有限公司惠贈）至各實驗室。

1.2 儀器與試劑 儀器:ABI 系列,DA7600,line-Gene,SLAN； 試劑: 中山大學達安基因股份有限公司，上海復星醫學科技發展有限公司，上海伯杰生物科技有限公司，湖南圣湘生物科技有限公司。

1.3 檢測方法 37 家臨床實驗室采用臨床基因擴增實時熒光定量法進行檢測。

1.4 統計方法 采用廠家提供靶值，PT 方案評定。

2 結果

質控物分發給37 家實驗室, 結果回報37 家，回報率100.0%。 2019-nCoV 核酸檢測室間質評各批號質控物靶值及實驗室PT 成績合格率見表1。2019-nCoV 結果Ct 值統計情況分別見表2 及表3。

表1 各批號質控物靶值及PT 成績合格率

表2 2019-nCoV ORFlab 基因Ct 值概況

表3 2019-nCoV N 基因Ct 值概況

3 討論

新型冠狀病毒肺炎(Corona Virus Disease 201 9,COVID-19)是SARS-CoV-2 感染導致的肺炎。 主要的傳播途徑是呼吸道飛沫傳播和接觸傳播。2019-nCoV 屬套式病毒目,冠狀病毒科,β 冠狀病毒屬[1]。 基因組有30kb 序列,與真核細胞mRNA 結構非常相似[2]。 當前獲批的核酸檢測產品普遍采用實時熒光定量PCR 法, 檢測靶標涉及SARS-CoV-2基因組序列中的核衣殼蛋白（N）基因、開放閱讀框1ab（ORF1ab）基因、包膜蛋白（E）基因、刺突蛋白（S）基因等[3]。 呼吸道標本或血液標本中實時熒光RT-PCR 檢測新型冠狀病毒核酸陽性作為重要的依據。 同時，測定SARS-CoV-2 核酸也是與流感病毒、腺病毒、呼吸道合胞病毒感染等其他病原體鑒別診斷的重要依據。 經治療后，患者出院的標準也將連續2 次呼吸道病原核酸檢測陰性 （間隔≥24 h）作為解除隔離出院的重要依據[4]。 對于實現快速確診感染病例、排除疑似病例，促進疫情的防控與臨床救治至關重要[5]。

3.1 2019-nCoV 肺炎屬乙類傳染病按甲類管理病毒核酸檢測需在二級生物安全并通過驗收的PCR 實驗室進行,操作人員按三級生物安全防護[6]。為了保證安全,本次室間質評活動質控物采用新型冠狀病毒假病毒作為樣本,僅對江西省衛健委公布的37 家核酸檢測實驗室分發了質控品，按《新型冠狀病毒肺炎實驗室檢測技術指南》 第五版要求進行檢測。 根據我省各實驗室使用的2019-nCoV核酸檢測試劑盒可能來源于不同廠商,本次室間質評只回報ORF1ab 基因和N 基因檢測結果。

3.2 目前各廠商主要提供定性檢測試劑 因本次室間質控物為均一物質, 每支質控物病毒含量一致，Ct 值有一定的可比性,并且通過Ct 值可以了解試劑盒的一些相關性能,所以要求同時回報定性結果和Ct 值。

3.3 結果的真實性 本次室間質評未提前通知參評實驗室，結果回報率為100.0%，體現出各實驗室對室間質評的重視。 除202013 和202015 這兩個批號合格率為97.3%外，其它三個批號合格率均為100.0%，36 家實驗室2019-nCoV 核酸檢測能力均合格,本次室間質評成績優秀，見表1。

3.4 不同品牌試劑批內變異系數有差異 可能與不同品牌試劑盒引物設計不同、各位點檢測靈敏度不同有關[7],從表2 和表3 可以看出2019-nCoV OR Flab 基因202013 批號樣本濃度最高，202011 批號最低；2019-nCoV N 基因202013 批號樣本濃度最高，202011 批號最低；達安基因組、上海伯杰組和其它組結果均一致。 達安基因組的產品使用率顯著性高于其它產品, 且中間濃度的Ct 值標準差和變異系數最小。 上海伯杰在各組中標準差和變異系數最小，可能是用戶數量相對較少的原因。

3.5 樣本202012 和202014 為陰性樣本 回報時，有5 家實驗室未填報Ct 值，有7 家回報“0”，有25家回報試劑說明書規定的非特異性擴增的最小循環數，故未做進一步分析；這兩個批號結果反映問題較為一致，所以只列出202012 批號數據。

3.6 循環閾值Ct 值與病毒模板起始拷貝數的對數存在線性關系[8]相同濃度的樣本不同廠家檢測Ct 值略有不同。 影響檢測結果Ct 值的因素貫穿整個試驗：靶RNA 降解、提取試劑盒的質量，耗材污染、移液器的準確性、人員操作、儀器擴增效率、引物設計和結果判讀等均可以影響Ct 值，見表2、表3。 例如圖1，閾值線選在L1 水平的Ct 值明顯大于L2 水平。 所以，在日常核酸檢測中，實驗室一定要有規范的管理文件,操作人員嚴格遵守標準化程序文件執行，把各種誤差降到最低。

圖1 閾值線對判讀結果Ct 值的影響

3.7 其它情況 組主要為湖南圣湘，因室間質評系統未錄入該試劑信息,所以在回報過程中歸為其它組。上海復星組用戶只有1 家,未做分析。在回報的數據中,有1 家實驗室未填寫檢測方法、儀器、試劑等信息，在分組統計過程中未列入任何組。

3.8 假陰性結果分析 有一家實驗室202013 和202015 這兩批號回報假陰性結果， 導致這兩批號合格率為97.3%。 通過查看這家實驗室回報數據,發現定性結果檢測方法為 “其它”, 儀器為“DA7600”,只有202011 批號回報了Ct 值,其它批號空白；一方面可能是回報錯誤,另一方面可能是實驗室人員操作不規范引起的假陰性,也可能是試劑耗材中存在抑制劑或其它因素引起的假陰性。結合此次檢測結果和回報數據， 該實驗室存在管理不規范的問題,希望能通過此次室間質評體現出來的問題查找原因。

本次室間質評未涉及臨床樣本采集、 運送和報告發放環節，只考核實驗室樣本處理、提取和檢測過程。 在感染者的肺泡灌洗液、鼻腔、痰液、糞便和血液樣本均可用于2019-nCoV 核酸檢測[9]。同一個病人作為臨床定性檢測項目，采樣時機不合適，不同病程、不同病情患者機體中不同采樣部位病毒載量可能不同[10]。此外2019-nCoV 為RNA 病毒,容易降解，樣本采集后應嚴格按照要求運送。

目前新冠病毒所致疾病其病理過程及臨床病程還未完全闡明，實驗室檢測路徑未標準化，加上其核酸檢測試劑盒研發時間緊迫,沒有足夠的評估及大樣本量的臨床驗證[11]，室間質評活動對于驗證各實驗室檢測結果的準確性和可比性極其重要，針對此次2019-nCoV 核酸檢測的質量管理, 江西省衛健委醫政醫管處委托江西省臨床檢驗中心開展的室間質評活動,表明了省衛健委推薦開展冠狀病毒核酸檢測的37 家臨床基因檢測實驗室核酸檢測能力合格,同時也進一步提示了臨床實驗室制定樣本采集及運送標準操作規程及對相關人員進行培訓，以提高檢測準確性的重要性和必要性。