循環腫瘤細胞在腫瘤精準醫學中的應用淺析

鄒暢，趙盼，胡鳳艷

（深圳市人民醫院臨床醫學研究中心 暨南大學第二臨床醫學院 南方科技大學第一附屬醫院，廣東 深圳518020）

惡性腫瘤已成為嚴重威脅中國人群健康的主要公共衛生問題,國家癌癥中心最新的統計數據顯示，惡性腫瘤死亡占居民全部死因的23.91%，且近十幾年來惡性腫瘤的發病死亡均呈持續上升態勢。 腫瘤精準醫學是一種基于腫瘤病人“定制”的醫療模式，即“對癥下藥”,根據每個腫瘤患者個體特征而定制和實施個性化治療方案。 癌癥精準醫學診斷檢查不僅限于基因和蛋白檢測, 包括遺傳、分子及細胞學信息、生活方式、環境信息達到在內的大數據綜合分析，旨在實現精確診斷[1]。 無創診療是腫瘤精準醫學發展的重要方向,目前臨床應用較多的主要是基于循環腫瘤細胞（Circulation tumor cell，CTC）和循環腫瘤DNA（ctDNA）的精準診療檢測產品[1]。 CTC 是指來源于原發腫瘤或轉移灶中能脫離基底膜并能通過組織基質入侵到外周血中的腫瘤細胞[1,2], CTC 可動態反應腫瘤的疾病進展,為腫瘤的早期診斷、預后評估、療效監測、復發轉移檢測、實時動態監測和個體化診療等，為腫瘤診療提供了一種簡便快捷的手段[1]。

1 循環腫瘤細胞的生物特性

CTCs 自身存在某些物理特性。第一，數量的稀有性[3]：CTCs 在外周血液中的含量極低，每毫升人外周血中檢測到的CTC 不到1 個, 而外周血液循壞中的紅、白、血小板等成分的數量級又十分巨大[4]。 第二，形態的非典型性[3]：CTCs 從原發部位或者轉移灶脫落進入血液循環后,隨著血液循環的快速流動,并在流動過程中受到血管壁的物理擠壓和機體免疫系統以及藥物的化學攻擊等作用, 導致CTCs 的大小,形態,以及表型等發生未知的改變。第三，CTCs 的異質性[3]：腫瘤在發生和轉移過程中會出現時間和空間上的異質性, 在這過程中CTCs 發生上皮-間質轉化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）,CTCs 表型動態變化。第四,具有更大的核質比，細胞核的形態各異[5]。 細胞形態的改變是機械性能改變的基礎,并為CTCs 提供多種功能。這種柔韌性可以促進它們從原發性腫瘤侵入遠端部位,并且可以賦予它們抵抗在轉移過程中受到血管內流體剪切應力損害的能力[6]。 也影響了它們的表面電荷和電性能。 以上特性使得CTCs 的微量捕獲和高靈敏的檢測成為后續分析的重要前提。

2 循環腫瘤細胞的富集、檢測和分析方法

2.1 CTCs 的分離富集技術 ⑴基于CTCs 和正常血液細胞在大小、 形態等方面存在差異特征分離CTCs。 通過設計一定濾過孔徑的聚碳酸酯膜，依據腫瘤細胞比正常血細胞直徑大的原理分離CTCs稱為ISET(Isolation by size of epithelial tumor cells)方法[7]。 通過此物理特征分離出的CTCs 形態完整，細胞表面表達的抗原未遭破壞,為后續進行免疫標記、染色等鑒定提供了可行性和準確性。 但外周血中的也存在著許多大體積細胞，又有部分CTCs 體積較血細胞相似甚至更小,從而降低了該分離方法的靈敏度和特異度。 ⑵基于CTCs 與其他血細胞表面抗原的差異以分離檢測CTCs。由于大部分CTCs表達細胞角蛋白（CK）,上皮細胞黏附分子(EpCAM)等上皮細胞標記, 通過靶向腫瘤細胞特異性抗原（CK、EpCAM） 的正向富集和靶向白細胞表面抗原標志物（CD45）的反向分離來進行免疫識別[8]。在免疫識別的基礎上結合特殊材料如：納米芯片，微流控，免疫磁珠等以實現CTCs 的有效分離[9]。 這類方法富集到的CTCs 特異性強，純度高。 但由于CTCs會發生EMT,使得利用上皮標志物的正向富集會遺漏具有轉移能力的那部分CTCs。因此，在現有的基礎上發展出更高效的, 特異性更強的通用的CTCs的腫瘤標記是一大要克服的難題。

2.2 CTCs 的識別鑒定技術 CTCs 的鑒定通常采用免疫細胞化學法（ICC），基于核酸的反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR），流式細胞術（FCM），熒光原位雜交（FISH），CanPatrol CTC 分型檢測技術等[8]。其中ICC 是將待檢測的細胞固定后,依據抗原抗體特異結合的基本原理,與熒光標記的細胞上皮性特異性抗原如EpCAM、CK 等的抗體進行結合。同時，在體系里加抗白細胞抗體來排除假陽性。 RT-PCR是從RNA 水平上進行的檢測,因CTCs 表達特異性的mRNA，而正常血細胞中不表達的差異來進行鑒定。 但該檢測方法需要破壞細胞的形態且敏感性偏低[10]。 FCM 是借助單克隆抗體和熒光染料結合CTCs 進行染色,而后對染色的CTCs 進行定量分析的技術。 可同時使用多種染料對靶細胞進行標記來提高特異性[11]。 FISH 是利用熒光素標記的核酸探針對CTCs 進行檢測。 此方法加入探針技術具有更高的敏感度和特異性,但這些優勢是在靶細胞的表面抗原標記是穩定狀態下適用。 CanPatrol CTC分型檢測技術運用納米膜過濾和RNA 原位雜交技術，采用針對上皮、間質mRNA 的熒光探針進行細胞原位雜交，將CTC 分為上皮型、間質型和混合型，是實現分型分析的CTC 檢測技術。

3 循環腫瘤細胞的臨床應用

3.1 腫瘤的早期診斷 CTCs 是存在腫瘤患者血液中一種具有活性的腫瘤細胞,其與惡性腫瘤的復發和轉移關系密切[12]。 隨著對CTCs 不同檢測技術和分析方法的發展和不斷的深入認識,已越來越多將其應用于腫瘤早期診斷、腫瘤分期、惡性腫瘤的輔助診斷和預后評估。對于腫瘤做到早發現,早治療，才能達到好的療效,目前早期診斷一般為影像學檢查，但該檢查對直徑小于5mm 的腫塊難以發現，提示當前的早期診斷技術具有自身的局限性[13]。有研究發現，利用陰性富集法對CTCs 進行檢測，發現原發性肺癌CTCs 陽性率（84%）明顯高于肺良性疾病組（4%）[14]。 Ried 等[15]研究者使用ISET 技術發現，在無癥狀但為高危因素人群中檢測到CTCs 的接近50%。這表明CTCs 對肺癌的早期診斷具有重要的價值。 季福慶等[16]對乳腺癌患者外周血中的CTCs 進行了檢測,發現CTCs 與乳腺癌患者腫瘤細胞轉移以及TNM 分期存在一定的相關性，對其臨床指導和預后具有指導意義，另外，Zhao 等人在體外分離擴增培養CTCs, 建立了一株來源于乳腺癌晚期患者外周血中的CTCs 的細胞系,并命名為CT C-3[17]，目前對其單細胞測序進行分析，旨在篩選出CTCs 特有的敏感性和特異性強的乳腺癌耐藥基因為尋找乳腺癌早期診斷提供科學依據。

3.2 腫瘤的分期及預后評估 CTCs 計數和表型的轉變能夠輔助腫瘤的定性及惡性程度的判斷，CTCs 計數越多提示病灶臨床分期可能越晚，可在一定程度上指導臨床決策。 對轉移腫瘤患者進行預后評估是目前CTC 臨床應用最廣泛的領域。 惡性腫瘤患者治療前后的CTC 類型和數目的變化具有重要的預后提示價值。 大量實驗證明CTC 的出現與晚期癌癥患者的預后密切相關[18,19]。 CTC 檢測作為一種簡單的血液檢測可隨時獲取用于評估患者的預后。

3.3 腫瘤的療效評價與用藥指導 抗腫瘤治療的療效監測是CTCs 另一重要臨床應用。 CTCs 檢測可作為影像學及臨床評分體系的補充,對患者的治療應答作出評價。 如在藥物治療后1~2 周, 通過CTCs 的檢測, 可觀察循環細胞類型和數量的改變預測治療效果。 CTCs 對化療療效評估已被多項研究證實[20,21]。 CTC 檢測不僅可提供預后預測、復發風險評估和療效監測, 同時CTC 的分子分析還可以反映患者腫瘤的基因信息，指導個體化用藥。

4 展望

CTCs 攜帶了腫瘤細胞的遺傳和生物學信息，可為腫瘤轉移、進展及化療敏感和耐藥性提供新的研究方向。 但目前對CTCs 的檢測技術仍不斷在完善,在世界范圍尚無一個測定與臨床應用的行業標準。 要實現CTCs 在腫瘤精準診療中的應用，未來可從CTCs 的富集、鑒定、計數到下游分析，利用納米芯片技術實現特異性的無損釋放富集到的CTCs[22], 并通過數字PCR 檢測技術和單細胞測序等技術,比較CTCs 與原發灶、轉移灶中基因組、轉錄組及表觀遺傳組的差異,為認識腫瘤發生、發展及轉移的生物學機制提供新的視角。 相比通過腫瘤組織標本鑒定基因組變化和基因表達改變的傳統模式,CTCs 攜帶的組學信息更具有研究意義,可準確和全面的提供癌癥轉移機制和獲得性耐藥的腫瘤遺傳學改變的信息[23-25]。 其次可以通過體外培養擴增腫瘤患者外周血中稀少的CTCs, 獲取足夠多的細胞，對其進行基因、蛋白、功能等各個層面的分析對于腫瘤精準醫療具有重要的臨床意義。 體外培養擴增的CTCs 可用于構建動物模型、耐藥及藥物敏感性試驗[26]等臨床前實驗，并提高CTCs 表型分析的精度鑒別出真正導致轉移的CTC 亞群的分子特征,進而以之構建轉移干預藥物的體外篩選平臺。 對于CTCs 的研究將有利于腫瘤患者早期診斷、輔助臨床進行精確治療、術后腫瘤復發與轉移及預后評估。