浩源核酸檢測系統的性能確認

王藝芳，葛文超，李俊英，呂永磊，方建華

（河南省紅十字血液中心，河南 鄭州450012）

按照《血站實驗室質量管理規范》[1]和《血站技術操作規程（2015 版）》[2]的要求，檢測設備在正式投入使用之前應經過確認，核酸檢測（nucleic acid test, NAT）設備還應進行分析靈敏度驗證，實驗室應建立血液檢測試劑的評價、選擇和確認程序。 因此，在核酸檢測設備投入使用前，需要通過性能確認了解其性能，確認是否達到預期，滿足實驗室日常檢測需要。 浩源核酸檢測系統于2018 年7 月份引進本實驗室，筆者通過通量測試、壓力測試、靈敏度驗證和平行試驗等方面,完成對浩源核酸檢測系統性能的評估,為其他實驗室的核酸檢測系統性能確認工作提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 標本來源 選取2018 年08 月本中心采集的無償獻血者標本。 獻血者均符合國家《獻血者健康檢查要求》中的相關要求。 采集每人份血液同時留取酶聯免疫吸附試驗（Enzyme Linked Immunosorbent Assay，ELISA）樣管和NAT 樣管，其中NAT 標本在采樣后4h 內于2~8 ℃1760g 離心20 min,2~8℃保存，24h 內上機進行檢測。

1.2 主要試劑、 儀器和NAT 試劑廠家 乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1 型）核酸檢測試劑盒（上海浩源生物科技有限公司, 批號：MF2 0180101）;乙型肝炎病毒丙型肝炎病毒人類免疫缺陷病毒（1+2 型）核酸檢測試劑盒（蘇州華益美生物科技有限公司，批號：MA20180403 等）。 配套耗材均由試劑公司提供，均在有效期內使用。 核酸檢測使用：ChiTaSBSS1200 核酸提取系統（美國PE公司）,Hamilton Star 全自動混樣儀（瑞士HAMILTON 公司），ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）,低溫大容量離心機KUBOTA 8730（日本KUB OTA 公司）。

1.3 血清盤 北京康徹斯坦核酸系列血清評價盤(系統性能驗證盤), 有36 份編號為P 系列樣本,其中包括HIV-1 RNA、HCV RNA 和HBV DNA 及陰性的樣本，見表1，進行8 人份混樣檢測。北京康徹斯坦核酸系列血清評價盤（分析靈敏度）, 分別由WHO HBV DNA 標準品（10/26 4）稀釋至9 IU/ml（6 個）、6 IU/ml（20 個）、3 IU/ml（6 個），WHO HCV RNA 標準品（06/102）稀釋至36 IU/ml（6 個）、24 IU/ml（20 個）、12 IU/ml（6 個），WHO HIV RNA-1標準品（10/152）稀釋至72 IU/ml（6 個）、48 IU/ml（20 個）、24 IU/ml（6 個），進行單人份檢測。

1.4 方法

1.4.1 通量測試 14h 內連續進行兩個批次的8 混檢模式檢測，每個批次均是滿負荷，含質控品和樣本。 所用樣本為實驗室當日檢測過的樣本，以驗證在滿負荷連續運行14h 內的檢測量。

1.4.2 壓力測試 使用浩源核酸檢測系統進行8 混檢模式檢測,連續運行檢測3d,共計檢測樣本2 232份（未包含質控品），觀察并記錄檢測系統的滿負荷的運行狀況以驗證在長時間運行時的系統穩定性。

1.4.3 分析靈敏度驗證 使用浩源核酸檢測系統對分析靈敏度血清評價盤進行單檢模式檢測，將HBV、HCV 和HIV-1 3 種病毒標準品隨機分布進行檢測， 并用IBM SPSS Statistics 19 分別分析其95%檢出限。

1.4.4 平行試驗 使用2018 年8 月6 日-11 日華益美檢測過的樣本進行檢測。

1.4.5 抗交叉污染 使用13 個陰性血漿樣本和53個陽性血漿樣本 （含HBV、HCV、HIV 強陽性或弱陽性樣本），交替放置8 混檢模式檢測。

1.4.6 檢測能力驗證 采用浩源核酸檢測系統對康徹斯坦血清盤進行8 混檢模式進行檢測。

2 結果

2.1 通量測試 1 臺浩源核酸檢測系統在14h 內可以完成1 488 份樣本的混樣模式檢測，運行過程中無故障發生。

2.2 壓力測試 每天進行744 份樣本混樣模式檢測,連續3d，模擬實際運行過程中最大的檢測壓力,在滿負荷狀態下連續運行3d，無故障和無效結果。

2.3 分析靈敏度驗證 分析靈敏度驗證的結果見表2，單人份檢測HBV DNA 95%檢出限為6.00 IU/ml，HCV RNA 95%檢 出 限 為24.00 IU/ml，HIV RNA-1 95%檢出限為48.00 IU/ml。

2.4 平行試驗 使用華益美檢測過的樣本進行檢測，有1 個pool 浩源混檢陽性而華益美混檢陰性，拆分陰性，其他結果均一致。

2.5 抗交叉污染 66 個樣本試驗，53 個陽性樣本均檢測為有反應性，13 個陰性樣本均為無反應性。陽性孔均未對鄰近孔位造成交叉污染。

2.6 檢測能力驗證 對康徹斯坦血清盤進行8 混檢模式進行檢測,檢測結果與血清盤說明書參考結果符合度100%。 見表1。

3 討論

病毒核酸檢測技術是直接檢測病原體核酸的一系列技術的總稱。 相比酶聯免疫檢測方法，血液病毒核酸檢測技術可以有效縮短抗原抗體免疫檢測的“窗口期”，從而大大降低經輸血傳播病毒的風險[3-6]。 目前全國血站核酸檢測工作已逐步在各地區普及[7]，更多的實驗室關注核酸檢測的質量更加注重核酸檢測系統性能確認工作。 國際輸血協會（International Society Blood Transfusion，ISBT）指出安裝確認（IQ）、運行確認（OQ）、性能確認（PQ）是設備確認的3 個連續階段,并對具體操作進行了說明[8]。 本實驗室在實施性能確認前對安裝調試完畢的浩源核酸系統的設備已進行評估,確保設備硬件和軟件的正確安裝,設備在可要求的范圍內正確運行。 目前，全自動NAT 儀器這樣的大型儀器IQ和OQ 通常由廠商的工程技術人員進行，而PQ 則需實驗室的設備使用人員來完成[9]。

表1 36 份編號為P 系列樣本背景清單

表2 浩源核酸檢測系統對WHO 標準品分析靈敏度的驗證結果

通過驗證操作性能（通量測試和壓力測試）和檢測性能（靈敏度驗證、平行試驗、抗交叉污染和檢測能力）兩個方面[10]，設計確認方案完成對浩源核酸檢測系統性能的評估。 通量測試是實驗室對浩源核酸檢測系統檢測量和檢測時間有一個預估計,14h 內可完成1 488 份樣本的8 混檢模式檢測，為今后日常檢測合理安排工作提供依據。 使用浩源核酸檢測系統進行8 混檢模式檢測,由于平常實驗室檢測量較大,在壓力測試測評價中模擬實際運行過程中最大的檢測壓力，并連續檢測，以此驗證了檢測系統的滿負荷運行狀況以在長時間運行時的系統穩定性。 靈敏度驗證方面，參考ELISA 弱陽性質控品來監控試驗的有效性和穩定性[11]，監控系統的趨勢變化。按照規程要求，結合NAT 自身特點和靈敏度血清盤結果, 筆者認為選擇最低檢測限0.5~2 倍檢出限的NAT 標準品作為分析靈敏度驗證的陽性樣本,其病毒含量明確，一致性較好，相對于日常檢測的血液樣本,更適用于新儀器的靈敏度檢測確認。 由表2 可知,分析靈敏度驗證HBV DN A、HCV RNA 和HIV RNA-1 95%檢出限為分別為6.00 IU/ml、24.00 IU/ml、48.00 IU/ml， 這與試劑說明書基本相符。 平行試驗評價采用另外一套系統當日檢測過的樣本進行檢測， 僅有1 個pool 混檢陽性，經拆分后為陰性，并在前一套系統內重復檢測，均為陰性。 分析原因：可能由于檢測方案、靈敏度的不同，出現了檢測結果的差異。由于NAT 防污染是必須重視的1 個問題[12]，實驗室在進行抗交叉污染評價之前，首先進行了防污染監控確認，確保實驗室環境、設備無污染。 其次將陽性（含HBV、HCV、HIV 強陽性或弱陽性樣本） 和陰性樣本混合交叉排列進行交叉污染的評估,可以有效的驗證儀器在匯集、 提取和擴增過程中對待測樣本的處理是否存在交叉污染[13]，便于日后出現多孔位反應性時，排除系統原因，分析污染原因。 系統性能驗證血清盤是一組含有陰性、強陽性、弱陽性樣本以及常見基因型樣本，通過混樣檢測，對檢測系統的準確性、基因型覆蓋面、弱陽性樣本的檢測能力、防交叉污染能力等方面進行綜合評價， 其檢測性能符合實驗室日常檢測要求。

通過性能確認,我們對浩源核酸檢測系統的綜合性能有了全面的了解,其操作性能和檢測性能基本符合實驗室日常檢測要求。 同時，根據實驗室日常的檢測量和檢測成本,在設計核酸檢測系統的確認方案時，除考慮滿足法律法規外，還應參加NAT室間質評實驗室能力評價活動,作為性能確認工作的補充，并對這一系列確認活動形成確認報告。