PDE-4 抑制劑對(duì)氯胺酮導(dǎo)致幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用

冀會(huì)娟，畢彥博，孟慧芳，李鵬超，樊青，胡振華

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)附屬鄭州人民醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州450002；2.河南省人民醫(yī)院麻醉科，河南 鄭州450005）

氯胺酮是肌肉松弛等小手術(shù)常用麻醉藥物之一，具有誘導(dǎo)快，鎮(zhèn)痛效果優(yōu)良，患者蘇醒快，呼吸系統(tǒng)抑制作用小等優(yōu)勢(shì)[1]。 但動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，氯胺酮可導(dǎo)致幼年大鼠短期、 遠(yuǎn)期學(xué)習(xí)記憶能力下降[2,3]。 磷酸二酯酶-4（Phosphodiesterase-4，PDE-4）抑制劑是一種具有抗炎效應(yīng)的藥物,目前常用的PDE-4 抑制劑有Ro20-1724、羅氟司特和西洛司特等。臨床研究表明[4]，PDE-4 抑制劑對(duì)氯胺酮引發(fā)的學(xué)習(xí)記憶障礙具有顯著療效。 海馬區(qū)是人學(xué)習(xí)、記憶的重要腦組織,該區(qū)域內(nèi)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白是cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號(hào)通路的重要介質(zhì)，與人學(xué)習(xí)、記憶功能密切相關(guān)。 為探討PDE-4抑制劑對(duì)氯胺酮導(dǎo)致幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的實(shí)際療效及對(duì)大鼠海馬區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 表達(dá)水平的影響,本組研究選取21d 40 只SD 大鼠進(jìn)行研究。 報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 選取21d SD 大鼠40 只，雌雄各半，購(gòu)自中科院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，室內(nèi)溫度22～26℃，濕度50～60%，自由攝食及飲水，晝夜各12h，隨機(jī)分為對(duì)照組，氯胺酮組，氯胺酮+PDE-4 抑制劑組，氯胺酮+PDE-4 抑制劑溶媒組，各組10 只后分籠飼養(yǎng)。兔抗鼠p-CREB抗體、 兔抗鼠EGFR 抗體以及兔抗大鼠BDNF 抗體由武漢伊艾博科技有限公司提供;氯胺酮由浙江九旭藥業(yè)有限公司提供；PDE-4 抑制劑Ro20-1724 由美國(guó)Sig-ma 公司提供；羊抗兔IgG 由北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 干預(yù)措施 對(duì)照組大鼠給予2ml 生理鹽水腹腔注射，30min 后再次注射2ml 生理鹽水; 氯胺酮組大鼠給予腹腔注射65mg/kg 氯胺酮（浙江九旭藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字：H20023609），30min 后注射2ml 生理鹽水; 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組大鼠給予同上氯胺酮注射，30min 后腹腔注入0.5mg/kg Ro 20-1724(美國(guó)Sig-ma 公司,進(jìn)準(zhǔn)字：070M1976V)；氯胺酮+PDE-4 抑制劑溶媒組大鼠給予同上氯胺酮注射，3min 后腹腔注射2ml 0.1%乙醇（Ro20-17 24 溶媒），隨后給予所有大鼠正常喂養(yǎng)7~8d。

1.2.2 Morris 水迷宮測(cè)試 各組大鼠Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)：于160cm 直徑,75cm 高度的圓形水池內(nèi)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，水深50cm，水溫約為25℃，滴入墨水染色，將水池分為4 個(gè)象限， 于第一象限放置一個(gè)低于水面2cm 的面積6×8cm 的長(zhǎng)方形平臺(tái)。 于給藥9d后每天8:00 按1~4 象限順序?qū)⒋笫蠓湃胨?，記?20s 內(nèi)大鼠從各入水點(diǎn)爬到平臺(tái)的時(shí)間， 并將其判定為逃避潛伏期。如大鼠于120s 內(nèi)找到平臺(tái)，則讓大鼠于平臺(tái)上留置30s，記錄相應(yīng)的逃避潛伏期；如大鼠未找到平臺(tái)，則引導(dǎo)其尋找平臺(tái)，讓大鼠于平臺(tái)上留置30s， 并將其逃避潛伏期記錄為120s。 連續(xù)實(shí)驗(yàn)5d，于第6d 撤去平臺(tái)，同前入水實(shí)驗(yàn)，記錄120s 大鼠穿過(guò)平臺(tái)原位置的次數(shù)。

1.2.3 Western blot 檢測(cè) Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后脫頸處死大鼠，打開(kāi)顱腦取出海馬組織，選用細(xì)胞裂解液提取海馬組織蛋白, 選用BCA 法進(jìn)行蛋白定量,并電泳轉(zhuǎn)膜，10ml 脫脂奶室溫下封閉60min，分別選用兔抗鼠p-CREB 抗體(l：500)、兔抗鼠EG FR 抗體(1：1000)以及兔抗大鼠BDNF 抗體(l：1500)進(jìn)行一抗,搖床孵化60min，選用酶標(biāo)羊抗兔IgG（1:2000）進(jìn)行二抗，孵化60min，曝光成像，選用美國(guó)Bio-Rad ChemiDoc MP 成像系統(tǒng)讀取結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0 軟件，計(jì)量資料采用（±s)表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗(yàn)。 P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠逃避潛伏期比較 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組第2d、 第3d 和第4d 逃避潛伏期明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組(P＜0.05),與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)表1。

2.2 各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較 氯胺酮+PDE-4抑制劑組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組（P＜0.05），與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表2。

2.3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF水平比較 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.761±0.100、0.370±0.081 和0.418±0.092,明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組(P＜0.05),與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。 見(jiàn)表3、圖1。

3 討論

表1 各組大鼠逃避潛伏期比較（s）

表2 各組大鼠穿越平臺(tái)次數(shù)比較

表3 各組大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 水平比較

圖1 Western blot 檢測(cè)圖

磷酸二酯酶(phosphodiesteras，PDEs)具有促環(huán)磷酸腺苷或環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷等細(xì)胞第二信使水解功能，并以此終止第二信使介導(dǎo)的生化反應(yīng)[5]。PDE-4抑制劑則可抑制PDEs 活性，并增強(qiáng)環(huán)磷酸腺苷或環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷表達(dá)[6]。PDE-4 抑制劑具有多種效應(yīng),如抗炎,其可抑制Th2 生成IL-4、IL-5 等炎癥介質(zhì),抑制細(xì)胞粘附因子表達(dá)。 PDE-4 抑制劑還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡, 促進(jìn)內(nèi)源性激素及兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)表達(dá)[7,8]。Ro20-1724 是新型PDE-4 抑制劑，本品可改善睡眠障礙, 并可改善鏈脲霉素及3-硝基丙酸引發(fā)的大鼠認(rèn)知功能障礙,其機(jī)制可能與現(xiàn)cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號(hào)通路有關(guān)[9]。但對(duì)于Ro20-1724是否可改善氯胺酮引發(fā)的幼兒認(rèn)知功能障礙癥狀及其機(jī)制，臨床研究較少,為此，我們進(jìn)行了本組研究。

本組研究發(fā)現(xiàn), 氯胺酮+PDE-4 抑制劑組第2d、第3d 和第4d 逃避潛伏期明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；并且氯胺酮+PDE-4 抑制劑組穿越平臺(tái)次數(shù)明顯高于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表面氯胺酮注射可引發(fā)大鼠學(xué)習(xí)、記憶功能障礙，而給予提示PDE-4 抑制劑治療后，大鼠學(xué)習(xí)、記憶障礙可得到有效恢復(fù)。 由于Ro20-1724 無(wú)法被水溶解，為此本組研究選用乙醇作為助溶劑[10]。 需要注意的是, 高劑量的乙醇給藥也可能引發(fā)腦組織學(xué)習(xí)、記憶障礙，因此本組研究將乙醇配置成1%濃度。

人腦學(xué)習(xí)、記憶等高級(jí)神經(jīng)活動(dòng)主要通過(guò)海馬區(qū)實(shí)現(xiàn)，當(dāng)大腦皮質(zhì)內(nèi)的神經(jīng)元接受到視覺(jué)、觸覺(jué)等感覺(jué)信息時(shí),神經(jīng)元會(huì)將這些信息傳遞至海馬區(qū)[11]。如海馬區(qū)存在反應(yīng)，神經(jīng)元將因此形成網(wǎng)絡(luò)，并存儲(chǔ)（記憶）/刪除（遺忘）某些信息。 EGFR 是表皮生長(zhǎng)因子受體的一種，廣泛存在于上皮、膠質(zhì)以及成纖維細(xì)胞內(nèi)。 EGFR 介導(dǎo)的信號(hào)路徑與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖以及分化密切相關(guān)[12]。 CREB 是一種具有基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)能力的蛋白質(zhì),當(dāng)環(huán)磷腺苷活化并誘導(dǎo)PKA 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核后，CREB 將被活化，并調(diào)控靶向基因表達(dá)。BDNF 是腦組織內(nèi)生成的一種蛋白質(zhì)，主要存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)，是神經(jīng)元分化、生長(zhǎng)以及存活的重要介質(zhì)[13]。 臨床研究顯示，海馬區(qū)記憶形成依賴于CREB 誘導(dǎo)下游BDNF 基因活化[14]。 本組研究中，氯胺酮+PDE-4 抑制劑組海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于氯胺酮組和氯胺酮+PDE-5 抑制劑溶媒組，與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, 提示PDE-4 抑制劑可通過(guò)抑制PDEs 活性， 增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞環(huán)磷腺苷表達(dá)，并激活PKA，活化CREB，最終作用BDNF 表達(dá)，激活整個(gè)cAMP/PKA-CREB-BDNF 信號(hào)通路， 逆轉(zhuǎn)氯胺酮引發(fā)的大鼠學(xué)習(xí)、記憶障礙[15]。

綜上所述，PDE-4 抑制劑可改善氯胺酮導(dǎo)致的幼年大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙,可能與其影響大鼠海馬CA1 區(qū)EGFR、CREB 和BDNF 蛋白表達(dá)有關(guān),PDE-4 抑制劑Ro20-1724 或可用于治療氯胺酮等麻醉藥物引發(fā)的學(xué)習(xí)、記憶障礙。