人臍帶間充質干細胞的分離技術優化及其快速檢測體系的建立

張岳漢，鐘志輝，黃林燕，劉宣瑜，邱振華

（高州市人民醫院干細胞與再生醫學中心，廣東 高州525200）

間充質干細胞主要是指一種源自中胚層，且具有自我更新以及多向分化潛能的成體肝細胞，廣泛存在于全身的器官間質以及結締組織中，主要囊括骨髓間充質干細胞、 臍帶間充質干細胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSC）以及脂肪間充質干細胞[1,2]。 其中UCMSC 具有來源豐富、獲取成本較低、不涉及論文問題以及對捐獻者無損害等優點,可能是未來間充質干細胞應用于醫療中最具有潛力的理想選擇[3]。 目前，臨床上應用于人UCMSC 分離培養的方式較多,且各有千秋，所獲得的細胞質量存在明顯的差異[4]。由此可知,如何獲取相對可靠、安全以及優質的UCMSC 已成為細胞分離生產技術的重大問題。 有研究報道顯示[5,6],間充質干細胞作為一類特殊的生物制劑藥物,于生產過程中必須保證生物學活性、分化能力以及增殖能力,同時需有效控制在此過程中外來微生物可能引起的感染。 鑒于此，本文通過研究人UCMSC 的分離技術優化及其快速檢測體系的建立效果并予以分析。 旨在為尋找一套可快速、可靠、安全的檢測體系,繼而于最短時間內對間充質干細胞實施監測，并回輸至宿主體內，為人UCMSC 的分離以及檢測尋找一種更加優化的手段，報告如下。

1 資料與方法

1.1 臍帶來源 選取2018 年3 月-2018 年6 月于我院進行分娩的20 例健康新生兒臍帶組織標本作為研究對象，將其以隨機抽簽法等分成2 份，即研究組與對照組。 納入標準：⑴所有新生兒臍帶組織均于產婦及其家屬同意下，由我院婦產科采集，即待胎盤徹底脫離母體后,采用無菌生理鹽水完成臍帶的清洗，隨后對臍帶兩端予以結扎，每例臍帶采集長度≥20cm；⑵新生兒均為足月分娩；⑶均為初產婦。 已獲得納入對象家屬同意，并得到醫院倫理委員會批準。

1.2 研究方法 ⑴傳統貼壁法：將所獲取的臍帶進行血管清除處理,隨后將其剪為0.5～0.8cm 的大塊，并接種在100mm 培養皿內, 保證臍帶切面向下貼壁,接種密度以25 塊為宜。 放置于培養箱中,于37℃，5%濃度的二氧化碳狀態下靜置5h，加入2ml 的培養液（主要為DMEM 培養液+10%FBS 培養液），并于24h 后再次加入10ml 的培養液。2d 后進行半量換液處理,之后定期5d 進行1 次全量換液，培養12d 后換液去除大部分的漂浮組織，待細胞≥80%左右貼壁或（繼而）較多局部細胞群落密集時，即可開始傳代。 ⑵優化分離技術：將獲取的臍帶去除血污并進行消毒，使用眼科剪將臍帶對半剪開，除去動靜脈,使用無菌刀柄將膠狀物從臍帶內壁上刮下來，將膠狀物剪碎1mm×1mm 大小，接種密度以300～350 小塊為宜。 將其置于培養箱中靜置30min后加入2ml 的原代培養液，放置于37℃，5%濃度的二氧化碳培養箱中進行培養處理， 并于24h 后再次加入10ml 的培養液。 之后定期6d 進行1 次全量換液,培養9d 左右若見組織泥漂浮于培養液中，去除大量的漂浮組織并予以換液，待細胞≥80%左右貼壁或（繼而）較多局部細胞群落密集時，即可開始傳代。 ⑶細胞體外培養傳代：每天于顯微鏡下對不同分離方式獲取的細胞生長情況予以觀察，并記錄獲取原代細胞生長所用時間,即初次見貼壁細胞以及80%貼壁/可傳代時間。⑷細胞計數：采集細胞懸液,500g 離心5min 處理，隨后采用細胞計數板完成細胞計數。 即待細胞懸液靜置30min 后，在顯微鏡下觀察,并計算細胞計數板4 個大方格內所具有的細胞數。 細胞得率計算公式為80%踢被細胞懸液總數與分離長度的比值。 ⑸細胞增殖情況檢測：分別取不同方式獲得的細胞，獲取第3 代、6代、9 代細胞。 以單細胞懸液為目標對其進行制備,并接種于24 孔板, 加入DMEM+10%FBS 培養液，放置在37℃，5%濃度二氧化碳的培養箱中進行培養。 定期3d 換液1 次，分別取3 孔不同代細胞的計數，取平均值。 ⑹檢測方式：對照組采用傳統細胞檢測方式； 研究組則采用質譜儀完成細菌感染性方面的檢測, 以熒光PCR 技術完成和支原體感染方面的檢測。 其中成骨分化茜素紅染色、成脂肪分化油紅“O”染色以及成軟骨分化切片染色，見圖1、圖2、圖3。

圖1 成骨分化茜素紅染色

圖2 成脂肪分化油紅“O”染色圖

圖3 成軟骨分化切片染色

1.3 觀察指標 比較兩組細胞生長情況以及得率情況，第3 代、6 代、9 代細胞的增殖情況，細胞檢測時間。

1.4 統計學方法 數據分析主要通過SPSS21.0 軟件進行處理，且以[n(%)]對計數數據實施表示，予以2 檢驗。以（±s）對計量數據實施表示，予以t 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組細胞生長情況以及得率情況對比 研究組初次見貼壁細胞時間、80%貼壁/可傳代時間相比對照組較低，而細胞得率相比對照組較高（均P＜0.05），見表1。

表1 兩組細胞生長情況以及得率情況對比（x±s）

2.2 兩組第3 代、6 代、9 代細胞的增殖情況對比研究組第3 代、6 代、9 代細胞4d、8d 時的細胞數均高于對照組（均P＜0.05），見表2、圖4。

圖4 處于增殖期的臍帶間充質干細胞

2.3 兩組細胞檢測時間對比 研究組細胞檢測時間為（0.81±0.15），相比對照組的（2.34±0.21）d 較低，差異明顯（t=18.748，P=0.000）。

3 討論

間充質干細胞的治療技術目前已得到國內外廣泛研究學者的關注,為部分疑難雜癥的治療帶來了希望[7-9]。 然而，干細胞治療的安全性、有效性不但和干細胞制劑的本身有關,同時與干細胞制備環節密切相關,間充質干細胞的制備是否符合質量標準，且不受污染影響，直接決定了其在臨床中的可行性、安全性[10-12]。 既往，臨床上應用較為廣泛的分離人UCMSC 的手段囊括組織塊法、 酶解組織法、聯合酶消化法等[13-16]。 不同的分離手段存在不同的優點和不足之處：其中組織塊法具有操作簡單、不會損傷細胞以及細胞活性較佳等優勢,然而該技術的培養周期相對較長，且獲得率不理想，無法迅速獲取人UCMSC。酶解組織法存在消化時間較長，傳代后細胞的貼壁率較低等缺陷[17,18]。 而聯合酶消化法消化時間較長，操作復雜，且由于消化時間的掌握難度較高，從而極易導致細胞粘附性下降，進一步引起貼壁率較低，最終導致試驗失敗[19,20]。 目前，臨床上針對間充質干細胞的細菌培養檢測所需時間較長，無法為細胞回輸的當天獲取結果，因此無法為細胞的回輸提供安全保障。 而隨著近年來醫療水平的不斷發展, 質譜技術以及熒光PCR 技術開始被應用于臨床中,可能成為間充質干細胞和質量檢測的有效手段，具有較高的臨床研究價值。

表2 兩組第3 代、6 代、9 代細胞的增殖情況對比（例，x±s）

本研究結果表明, 研究組初次見貼壁細胞時間、80%貼壁/可傳代時間相比對照組較低，而細胞得率相比對照組較高，與此同時，研究組第3 代、6代、9 代細胞4d、8d 時的細胞數均高于對照組，這表明了優化法應用于人UCMSC 的獲取中具有高效、穩定的優勢，且操作簡單、可控性強，值得臨床推廣應用。 究其原因，本研究所采用的優化法主要是利用了人UCMSC 的趨化性特點，促使其自發聚集于創口部位，繼而爬出組織且開始貼壁生長。 同時， 該法有利于細胞維持原有的活性以及生長趨勢，且在分離過程中會對細胞造成損傷，因此在換液傳代后可獲得更為明顯的細胞增殖能力。 此外，該法所獲取的臍帶組織更為細小,從而使得其貼壁牢固性更佳，繼而可縮短爬出細胞的時間，進一步縮短可傳代用時。 筆者體會：優化法主要是利用物理方式自臍帶膠狀組織內提取UCMSC, 且相比傳統貼壁法帶臍帶內皮組織一起剪碎等一步驟，在一定程度上縮短了操作時間。 其在刮下來的膠狀組織，更有利于貼壁，并在加液后不會輕易漂浮，細胞更易爬出，獲得到的細胞更純。 加之換液的次數相對較少，可有效節省人力物力。 另外，研究組細胞檢測時間相比對照組較低,這提示了快速檢測體系的建立有利于縮短人UCMSC 的檢測時間，避免了醫療資源的浪費，減輕了醫務人員的工作量。究其原因,筆者認為質譜儀主要是利用高能電子流等對樣品分子予以“轟擊”，從而促使該分子喪失電子轉變成待正電荷的分子離子以及碎片離子，而上述差異性離子的質量不同,與磁場的作用下到達檢測器的時間亦存在差異，繼而形成質譜圖，為臨床檢測提供可快速、可靠的數據。熒光PCR 主要是指于PCR 反應體系內加入熒光基團, 從而利用熒光信號對整個PCR 過程予以監測, 隨后利用標準曲線完成未知模板定量分析的一種手段,目前已被廣泛應用于臨床中，效果明顯[21]。

綜上所述，優化法可高效、低成本地獲取高質量人UCMSC, 且與操作方面完全可建立一套規范的標注你操作規程以及質量控制流程。 同時，快速檢測體系的建立可顯著縮短人UCMSC 的檢測時間，有利于避免醫療資源的過度浪費，值得臨床推廣應用。