血培養(yǎng)陽(yáng)性?xún)x器報(bào)警時(shí)間分析

李杰芬，儲(chǔ)從家，李雪梅，孫麗，陳靜宜，張良艷，管新龍

（玉溪市人民醫(yī)院，云南 玉溪653100）

血流感染（bloodstream infection,BSI)是一種嚴(yán)重的全身感染性疾病，近年來(lái)由于靜脈導(dǎo)管留置、機(jī)械通氣、腸外給藥等侵入性設(shè)備及治療的廣泛應(yīng)用,以及免疫抑制劑及大量抗菌藥物的濫用[1]，血流感染的發(fā)病率及死亡率呈全球性的增長(zhǎng),致死率較高的膿毒癥,每年以1.5%~8.0%的速度增加[2]。為了縮短血流感染診斷的時(shí)間，降低患者的死亡率，血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間的監(jiān)測(cè)顯得尤為重要,本次研究血培養(yǎng)陽(yáng)性病原菌的儀器報(bào)警時(shí)間,大概推斷病原菌種類(lèi),給臨床感染性疾病的診斷和治療提供有利的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 2017 年1-12 月臨床各科室送檢的血培養(yǎng)標(biāo)本（均為需氧和厭氧雙瓶培養(yǎng)），去除同一病例同一部位所獲重復(fù)菌株。

1.2 儀器與試劑 法國(guó)梅里埃公司Bact/Alert 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀及配套血培養(yǎng)瓶。 VITEK 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定藥敏分析儀及配套鑒定卡。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本的采集與培養(yǎng) 按臨床微生物血培養(yǎng)操作規(guī)范進(jìn)行標(biāo)本的采集與培養(yǎng)[3]。

1.3.2 陽(yáng)性培養(yǎng)瓶的處理 儀器報(bào)陽(yáng)時(shí), 記錄報(bào)陽(yáng)時(shí)間，轉(zhuǎn)種血平板和巧克力平板，分別置35℃普通培養(yǎng)箱、35℃5%CO2培養(yǎng)箱、厭氧陽(yáng)性轉(zhuǎn)種斯氏厭氧培養(yǎng)基放厭氧袋培養(yǎng)24~48h, 同時(shí)涂片做革蘭染色,涂片見(jiàn)真菌孢子及菌絲者再同時(shí)轉(zhuǎn)種沙保羅培養(yǎng)基。 分離菌株做進(jìn)一步鑒定。

1.3.3 結(jié)果判定 儀器報(bào)警且涂片陽(yáng)性, 及時(shí)轉(zhuǎn)種培養(yǎng)，有細(xì)菌生長(zhǎng)為陽(yáng)性，轉(zhuǎn)種無(wú)菌生長(zhǎng)及涂片未見(jiàn)細(xì)菌者為假陽(yáng)性。 儀器培養(yǎng)5d 未報(bào)警，轉(zhuǎn)種無(wú)菌生長(zhǎng)者為陰性。

1.3.4 細(xì)菌及真菌鑒定 采用VITEK 2 Compact 進(jìn)行鑒定。 厭氧菌的鑒定采用API 鑒定條進(jìn)行鑒定，馬爾尼菲青霉菌采用棉蘭染色、雙相培養(yǎng)結(jié)合菌落形態(tài)判斷, 馬耳他布魯菌最終以血清凝集試驗(yàn)確認(rèn)。

1.3.5 采用WHONET 5.6 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析（同一患者的相同菌株只做一次分析） 及SPSS13.0 統(tǒng)計(jì)軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 血培養(yǎng)陽(yáng)性率 2017 年血培養(yǎng)共18859 例，陽(yáng)性標(biāo)本共871 例, 陽(yáng)性分離率為4.62%（871/1885 9）,分離細(xì)菌共876 株（其中有5 份陽(yáng)性標(biāo)本均分離到兩株菌），革蘭陽(yáng)性菌占53.77%，革蘭陰性菌占44.18%，真菌占1.03%，厭氧菌占1.03%；扣除因故未做細(xì)菌鑒定97 株和檢出兩種菌的5 例標(biāo)本（共10 株菌）,剩下的769 株納入統(tǒng)計(jì)分析，葡萄球菌占37.19%（286 株）, 腸桿菌科占35.89%（276株），鏈球菌屬占6.11%（47 株），陽(yáng)性桿菌占5.33%（41 株）,非發(fā)酵菌占5.20%（40 株）,腸球菌占2.60%（20 株），馬耳他布魯菌占2.34%（18 株），真菌占1.17%（9 株）,厭氧菌占1.17%（9 株）,其他占2.99%（23 株）；其中需氧培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本共571 例，厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本共475 例。

2.2 769 例血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間與細(xì)菌分布 571例需氧培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌分布和報(bào)警時(shí)間分析，≤12h、≤24h、≤48h、≤72h、≤96h、≤120h 的病原菌分布分別為153 株（26.80%）、369 株（64.62%）、493株（86.34%）、540 株（94.57%）、566 株（99.12%）、571 株（100.00%）。除真菌和馬耳他布魯菌外，所有報(bào)警中位時(shí)間均在48h 內(nèi),腸桿菌科細(xì)菌陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間最早，馬耳他布魯菌報(bào)警時(shí)間最晚。 血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間從早到晚依次是：腸桿菌科、鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、非發(fā)酵菌、革蘭陽(yáng)性桿菌、真菌、馬耳他布魯菌。 見(jiàn)表1。

475 例厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性細(xì)菌分布和報(bào)警時(shí)間分析，≤12h、≤24h、≤48h、≤72h、≤96h、≤120h 的病原菌分布分別為185 株(38.95%)、365 株(76.84%)、440 株(92.63%)、456 株(96.00%)、465 株(97.89%)、475 株(100.00%)。 除厭氧菌外，所有報(bào)警中位時(shí)間均在48h 內(nèi)， 腸桿菌科細(xì)菌陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間最早，厭氧菌報(bào)警時(shí)間最晚。 血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間從早到晚依次是：腸桿菌科、鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、非發(fā)酵菌、革蘭陽(yáng)性桿菌、厭氧菌。 見(jiàn)表2。

3 討論

血培養(yǎng)陽(yáng)性是血液感染病原學(xué)診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，全自動(dòng)血培養(yǎng)儀自動(dòng)化程度高,應(yīng)用廣泛，對(duì)不同種類(lèi)的微生物有不同的陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間,結(jié)合微生物相對(duì)特有的生長(zhǎng)特點(diǎn), 初步推斷微生物生長(zhǎng)種類(lèi)，方便臨床給出較快速的治療方案。

表1 571 份血培養(yǎng)需氧培養(yǎng)陽(yáng)性（株）與報(bào)警時(shí)間

表2 475 份血培養(yǎng)厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性（株）與報(bào)警時(shí)間

本資料顯示，血培養(yǎng)陽(yáng)性率為4.62%，低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[4,5]，可能與臨床病例的選擇、標(biāo)本的采集和送檢等檢驗(yàn)前標(biāo)本的質(zhì)量以及微生物檢驗(yàn)手段和操作技能有關(guān)[6]。

研究顯示，除真菌、馬耳他布魯菌和厭氧菌由于其特殊的培養(yǎng)環(huán)境外,血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間從短到長(zhǎng)的順序均為：腸桿菌科、鏈球菌、腸球菌、葡萄球菌、非發(fā)酵菌、革蘭陽(yáng)性桿菌，厭氧瓶報(bào)陽(yáng)時(shí)間短于需氧瓶報(bào)陽(yáng)時(shí)間。

腸桿菌科細(xì)菌為兼性厭氧菌， 對(duì)培養(yǎng)條件要求不高，細(xì)菌增殖快，CO2產(chǎn)生快而且量多[7,8]，所以陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間比其他菌屬短。需氧培養(yǎng)陽(yáng)性的218株和厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性的233 株腸桿菌科細(xì)菌，12h 內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警分別為124 株和151 株,分別占56.8 8%和64.81%，24h 內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警均為202 株，分別占92.66%和86.70%，48h 內(nèi)出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警分別為213 株和221 株,分別占97.71%和94.85%；與文獻(xiàn)報(bào)道[9]相似，最早出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間是大腸埃希菌，培養(yǎng)時(shí)間僅為1.92 h。 非發(fā)酵菌為需氧或兼性厭氧菌， 不分解葡萄糖或僅以氧化形式利用葡萄糖，培養(yǎng)瓶由于含有血液等耗氧物質(zhì)，影響非發(fā)酵菌的生長(zhǎng)環(huán)境，導(dǎo)致生長(zhǎng)較緩慢，最遲出現(xiàn)陽(yáng)性時(shí)間為58.74h。

鏈球菌屬多數(shù)為兼性厭氧菌,少數(shù)為專(zhuān)性厭氧菌，營(yíng)養(yǎng)要求高，對(duì)糖分解能力不定，這些因素使鏈球菌在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)速度變慢，CO2產(chǎn)生量少，需氧和厭氧陽(yáng)性報(bào)警中位時(shí)間分別是15.12h 和14.40h。腸球菌為需氧和兼性厭氧菌，對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求、生長(zhǎng)速度快慢與鏈球菌相似,其需氧和厭氧陽(yáng)性報(bào)警中位時(shí)間分別為21.48h 和16.68h，均<24h,與相關(guān)文獻(xiàn)[10]報(bào)道一致。

葡萄球菌為需氧和兼性厭氧菌,對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求不高,對(duì)碳水化合物發(fā)酵反應(yīng)不定，分解葡萄糖產(chǎn)酸，所以CO2產(chǎn)量和速度都不如腸桿菌科細(xì)菌。 有文獻(xiàn)報(bào)道[11]血培養(yǎng)污染菌群分布以凝固酶陰性葡萄球菌（Coagulase negative staphylococcus,CNS）為主，占73.3%。 相關(guān)研究也認(rèn)為CNS 的血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間TTP 與血液帶菌量的對(duì)數(shù)呈負(fù)相關(guān)，CNS血液帶菌量的多少與其是否為污染菌有關(guān),目前還沒(méi)有鑒別血培養(yǎng)病原菌與污染菌的金標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)室可依據(jù)實(shí)驗(yàn)室結(jié)果結(jié)合臨床癥狀、 增加血培養(yǎng)送檢套數(shù)（已有相關(guān)報(bào)道[12]）來(lái)綜合判斷血培養(yǎng)是否為污染菌。

真菌感染時(shí),真菌對(duì)糖代謝能力遠(yuǎn)低于普通細(xì)菌，CO2產(chǎn)生量少，出現(xiàn)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間較細(xì)菌遲，報(bào)警中位時(shí)間為61.92h，與徐權(quán)等[10]的研究結(jié)果不一致（17 株標(biāo)本平均獲得陽(yáng)性時(shí)間為1.44d，即34.56 h),可能與研究菌株較少和本次分離的真菌菌種構(gòu)成有關(guān)(本次9 株真菌中包含馬爾尼菲青霉菌6 株和新型隱球菌2 株)，據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[13]，所有被馬爾尼菲青霉菌感染的血液樣本,通過(guò)Bact/Alert 3D全自動(dòng)血培養(yǎng)儀培養(yǎng)后, 陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間最快為2d（天）,最慢為9d，平均為4.0d，故懷疑馬爾尼菲青霉菌感染時(shí)應(yīng)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間。 真菌培養(yǎng)需要較長(zhǎng)時(shí)間，一般多數(shù)酵母菌的孵育時(shí)間為2~4d，某些酵母菌（如光滑假絲酵母和新型隱球菌）需要延長(zhǎng)孵育時(shí)間。 目前疑似假絲酵母菌血癥患者的血培養(yǎng)，半數(shù)情況下沒(méi)有培養(yǎng)出陽(yáng)性結(jié)果,有文獻(xiàn)報(bào)道[14],對(duì)于細(xì)菌和真菌雙重感染病人,采用傳統(tǒng)的血培養(yǎng)瓶對(duì)假絲酵母菌血癥檢測(cè)不適合,因?yàn)榧?xì)菌的生長(zhǎng)會(huì)掩蓋真菌的生長(zhǎng),真菌特異性培養(yǎng)基對(duì)于擴(kuò)散性真菌感染的檢測(cè)更有利。 確診真菌感染往往需要等待實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果和典型臨床表現(xiàn)， 這也增加了臨床診斷的難度。

厭氧菌（anaerobicbacteria）缺乏完整的代謝酶體系，其能量代謝以無(wú)氧發(fā)酵的方式進(jìn)行，故其代謝能力較低，生長(zhǎng)緩慢,報(bào)警陽(yáng)性時(shí)間也相對(duì)較長(zhǎng)。

馬耳他布魯菌為專(zhuān)性需氧菌,僅可利用少量的碳水化合物, 故生長(zhǎng)緩慢。 其中位報(bào)警時(shí)間為72.84h,與文獻(xiàn)報(bào)道[15]的布魯菌中位報(bào)警時(shí)間72.3h較為接近,也與布魯菌的峰期相符,一般為3~4 天。

本次研究還發(fā)現(xiàn),需氧厭氧配對(duì)培養(yǎng)能得到更高的陽(yáng)性率，如只單純做需氧或厭氧培養(yǎng)，均會(huì)導(dǎo)致部分菌的漏檢，相關(guān)文獻(xiàn)已有報(bào)道[16]。

綜上所述，血培養(yǎng)儀檢出陽(yáng)性時(shí)間快，需氧和厭氧培養(yǎng)陽(yáng)性48h 分別可達(dá)到86.34%和92.63%，報(bào)警陽(yáng)性時(shí)間最早為1.92h, 不同種類(lèi)細(xì)菌的陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間范圍又有較多重疊,提示血培養(yǎng)陽(yáng)性報(bào)警時(shí)間還可能與血液中最初的細(xì)菌量、 抗生素抑制等其他因素有關(guān)。