檢測(cè)HLA-B27+/B7- 在診斷強(qiáng)直性脊柱炎中的臨床價(jià)值

董玉蘭，徐冉，余志宏，馬亮

（景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 景德鎮(zhèn)333000）

強(qiáng)直性脊柱炎 （Ankylosing spondylitis，AS）是脊柱關(guān)節(jié)炎（Spondyloarthritis，SpA）常見的臨床類型，以中軸關(guān)節(jié)受累為主，可伴有關(guān)節(jié)外表現(xiàn)，嚴(yán)重者可發(fā)生脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直， 影響患者生存質(zhì)量。多見于青壯年男性，20～30 歲發(fā)病較多。多數(shù)患者進(jìn)展緩慢、病情隱匿，往往不能引起人們的重視。 該疾病的主要診斷依據(jù)臨床癥狀和影像學(xué)檢查，但在疾病早期骨骼未發(fā)生改變，影像學(xué)特征不是很明顯如X 線還只是出現(xiàn)Ⅰ級(jí)或Ⅱ級(jí)改變，臨床癥狀又與其他疾病非常相似難以區(qū)分， 因此容易發(fā)生漏診和誤診。國(guó)內(nèi)的流行病學(xué)表明，我國(guó)AS的發(fā)病率為0.2%～0.45%[1]，而臨床上約90%的AS患者HLA-B27+/B7-陽(yáng)性[1]。 因此，HLA-B27+/B7-的檢測(cè)在該病的診斷和鑒別診斷中具有重要價(jià)值。流式細(xì)胞儀使用熒光素和單克隆抗體,可多參數(shù)同時(shí)測(cè)定，具有高靈敏度、特異性，并用計(jì)算機(jī)進(jìn)行光信號(hào)的數(shù)據(jù)處理分析,提高了檢測(cè)速度與統(tǒng)計(jì)分析的精確性,實(shí)現(xiàn)了單細(xì)胞的高效、特異性分析。標(biāo)本之間、不同實(shí)驗(yàn)室之間重復(fù)性好,被廣泛應(yīng)用于人類白細(xì)胞抗原B27 的檢測(cè)。 本研究旨在用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HLA-B27+/B7-的表達(dá),以及其在AS 診斷和鑒別診斷中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2012 年6 月至2018 年1 月景德鎮(zhèn)市第一人民醫(yī)院門診和住院AS 患者(AS組)82 例，其中男70 例，女12 例，年齡10～75 歲，平均34.6 歲；腰椎間盤突出癥（lumbar intervertebral disc herniation，LDH）患者（LDH 組）50 例，其中男19 例，女31 例，年齡29～78 歲，平均52.8 歲；健康體檢者（正常對(duì)照組）40 例,其中男34 例，女6例，年齡15～72 歲，平均35.8 歲，均為該院體檢中心健康體檢者。 所有患者均符合指南診斷標(biāo)準(zhǔn)，并經(jīng)相關(guān)科室醫(yī)生確認(rèn)。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 所有AS 患者均符合2010 年中華醫(yī)學(xué)會(huì)風(fēng)濕病學(xué)分會(huì)強(qiáng)直性脊柱炎診斷及治療指南[2]的標(biāo)準(zhǔn)。所有腰椎間盤突出癥患者均符合2015年安徽省腰椎間盤突出癥分級(jí)診療指南[3]的標(biāo)準(zhǔn)。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴診斷明確， 病歷資料完善者；⑵健康體檢者心、肝、肺、腎、眼等功能基本正常。 ⑶研究對(duì)象簽署知情同意書并積極配合檢查。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) 符合下列條件之一者即排除：⑴臨床資料不全者；⑵妊娠或哺乳期婦女；⑶合并有其他疾病引起的精神及行為異常者;⑷不符合納入標(biāo)準(zhǔn)者。

1.5 儀器與試劑 儀器采用美國(guó)貝克曼公司的Beckman-Coulter FC500 流式細(xì)胞儀, 單克隆抗體HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE、IgG2a-FITC/IgG1-PE、 溶血素、 鞘液均來自貝克曼公司的標(biāo)準(zhǔn)試劑盒。

1.6 方法 清晨空腹采集EDTA-K2 抗凝靜脈血2ml，取2 支流式專用管，做好標(biāo)記，一支為同型對(duì)照管，另一支為測(cè)定管，向兩管各加入全血50μl，然后向同型對(duì)照管加入IgG2a-FITC/IgG1-PE 試劑10μl，測(cè)定管加入HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 試劑10μl， 振蕩混勻后室溫避光孵育15～20min，然后依次向各管中加入溶血素500μl，混勻后室溫避光孵育10min， 待完全溶血后500×g 離心5min,棄上清。加入500μl PBS 洗滌一次，500×g 離心5min，棄上清。 加500μl 含1%多聚甲醛的PBS 懸浮細(xì)胞，混勻后上機(jī)檢測(cè)或置于4～8℃冰箱待測(cè)。

1.7 質(zhì)量控制 實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行光路、流路的校正和熒光補(bǔ)償，設(shè)置陰性對(duì)照管。 用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球進(jìn)行儀器校準(zhǔn)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)分析采用SPSS19.0 統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)數(shù)資料用百分率表示,組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 獲取數(shù)據(jù) 采用流式細(xì)胞儀自帶的軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。 如圖1 所示，先通過FS-SS 雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門,區(qū)分經(jīng)溶血素裂解紅細(xì)胞處理后外周血白細(xì)胞中淋巴細(xì)胞、 單核細(xì)胞和粒細(xì)胞三個(gè)群體。 獲取5000 個(gè)淋巴細(xì)胞，然后再分析5000 個(gè)淋巴細(xì)胞中HLA-B27+/HLA-B7-細(xì)胞群的百分比和熒光強(qiáng)度見圖2，如果大于或等于儀器設(shè)定的界值報(bào)告陽(yáng)性，否則報(bào)告陰性。

圖1 通過FS Lin/SS Lin 雙參數(shù)圖圈定淋巴細(xì)胞設(shè)門

圖2 淋巴細(xì)胞中HLA-B27+/B7- 細(xì)胞群的熒光強(qiáng)度和百分比

2.2 AS 患者的年齡及性別分布情況 AS 患者中男性多于女性，男女比例為5.8:1，其中以青壯年男性（<40 歲）的發(fā)病率最高，占61.0%，見表1。

表1 AS 患者的年齡及性別分布情況[n(%)]

2.3 HLA-B27+/B7-陽(yáng)性率比較 AS 組HLA-B27+/B7-的陽(yáng)性率為89.0%(73/82),顯著高于LDH 組（P<0.01）和正常對(duì)照組的陽(yáng)性率（P<0.01）。 而對(duì)照組與LDH 組之間的陽(yáng)性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P>0.05），見表2。

表2 AS 患者、LDH 患者與健康體檢者HLA-B27+/B7- 的陽(yáng)性率比較

2.4 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)HLA-B2 7+/B7-的各項(xiàng)臨床評(píng)價(jià)指標(biāo) HLA-B27+/B7-檢測(cè)對(duì)診斷AS 的靈敏度為89.0%( 73/82) ,特異度為95.0%( 38/40)，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.3%（73/75）， 陰性預(yù)測(cè)值為80.9%（38/47），陽(yáng)性似然比為17.8，陰性似然比為0.1，見表3。

表3 各項(xiàng)臨床評(píng)價(jià)指標(biāo)結(jié)果

3 討論

HLA-B27 作為免疫遺傳標(biāo)記抗原, 幾乎表達(dá)于所有有核細(xì)胞表面上，特別是淋巴細(xì)胞表面，在免疫系統(tǒng)中主要負(fù)責(zé)細(xì)胞之間的相互識(shí)別,誘導(dǎo)免疫反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答。 HLA-B27 分子可以和一些自身肽段結(jié)合,形成復(fù)合體在自身細(xì)胞膜上表達(dá)后，能被相應(yīng)的CD8+T 細(xì)胞識(shí)別，從而導(dǎo)致T 細(xì)胞對(duì)自身靶細(xì)胞的殺傷，造成組織變性、器官受損[4]。本研究中對(duì)82 例確診AS 患者用FCM 進(jìn)行HLAB27+/B7-檢測(cè)分析后發(fā)現(xiàn), 受檢者中男女之比為5.8:1(70/12)，且小于40 歲男性占61.0%，說明AS主要在青壯年男性發(fā)病率高,這與流行病學(xué)資料相一致，也有認(rèn)為可能是女性患者病情相對(duì)更緩和，臨床醫(yī)生對(duì)女性患者的認(rèn)識(shí)不足,還有研究認(rèn)為女性在HLA-B27 陰性的AS 患者中顯示出更高的比例[5]。 本研究發(fā)現(xiàn)有一對(duì)AS 患者父女HLA-B27+/B7-檢測(cè)都為陽(yáng)性, 另有一例患者明確有強(qiáng)直性脊柱炎家族病史, 提示本病發(fā)病機(jī)制可能與遺傳有關(guān)。 又有研究表明大約10%HLA-B27 陽(yáng)性AS 患者的一級(jí)親屬將來會(huì)發(fā)展為AS[6]，并且HLA-B27陽(yáng)性AS 患者其發(fā)病年齡早、癥狀重，預(yù)后及轉(zhuǎn)歸均較差[7]，因此臨床上有必要對(duì)HLA-B27 陽(yáng)性的一級(jí)親屬開展HLA-B27+/B7-的檢測(cè)。 根據(jù)最近的研究表明,TREML2（表達(dá)在骨髓細(xì)胞激發(fā)受體家族成員之一） 基因的突變是一個(gè)導(dǎo)致散發(fā)和家族中HLA-B27 陽(yáng)性AS 病人的主要因素。 更者，TREML2 可能會(huì)作為AS 的一個(gè)易感基因。 這些發(fā)現(xiàn)提供了一個(gè)更好地理解AS 發(fā)病的分子機(jī)制和新的治療靶點(diǎn)[5]。

本研究中HLA-B27+/B7-檢測(cè)對(duì)診斷AS 的靈敏度為89.0%( 73/82),特異度95.0%( 38/40) 。 陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為97.3%（73/75）,陰性預(yù)測(cè)值為80.9%（38/47），陽(yáng)性似然比為17.8，陰性似然比為0.1。 顯示AS 與HLA-B27+/B7-成正相關(guān)。 值得注意的是，82例確診為AS 患者有9 例為HLA-B27+/B7-結(jié)果陰性,同樣的,50 例LDH 患者有3 例HLA-B27+/B7-結(jié)果陽(yáng)性以及40 例健康體檢者也有2 例HLA-B27+/B7-結(jié)果陽(yáng)性，因此AS 的診斷必須結(jié)合臨床癥狀、X 線及其他檢查綜合做出分析。 雖然根據(jù)1984 年修訂的紐約標(biāo)準(zhǔn)HLA-B27 陽(yáng)性不能作為AS 的診斷依據(jù)，但隨著人們對(duì)疾病的不斷認(rèn)識(shí)，2009 年及2011 年國(guó)際脊柱關(guān)節(jié)炎專家評(píng)估協(xié)會(huì)（ASAS），先后提出了中軸型和外周型SpA 新的脊柱關(guān)節(jié)炎分類，尤其是更加強(qiáng)調(diào)了HLA-B27 陽(yáng)性對(duì)診斷中軸型SpA 的重要性[7]，將HLA-B27 陽(yáng)性納入診斷中軸型SpA 的指標(biāo)之一。 基于這種情況，若患者臨床上有腰骶髂關(guān)節(jié)部疼痛癥狀，X 線檢查陰性，而HLA-B27 檢測(cè)陽(yáng)性, 應(yīng)高度警惕處于強(qiáng)直性脊柱炎發(fā)病早期。

臨床上AS 表現(xiàn)復(fù)雜多樣，患者第一次就診時(shí)最容易被誤診為腰椎間盤突出癥[8],這是臨床上比較多見的需要對(duì)這兩種疾病進(jìn)行鑒別。 雖然炎性腰背痛是AS 病變過程中的典型臨床特征，但并非所有AS 患者的首發(fā)癥狀。 炎性背痛滯后的出現(xiàn)加上早期X 線的不典型表現(xiàn)以及現(xiàn)代生活方式的改變使得很多AS 患者就診時(shí)被誤診為腰椎間盤突出癥引起。 根據(jù)馬驍?shù)葟?qiáng)直性脊柱炎誤診情況分析，易誤診的前五種疾病為腰椎間盤突出、腰肌勞損、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、坐骨神經(jīng)痛、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎[8]。本次研究中AS 患者陽(yáng)性率為89.0%,而50 例LDH患者,只有3 例HLA-B27+/B7-陽(yáng)性,陽(yáng)性率為6.0%,兩組患者陽(yáng)性率具有顯著差異（P<0.01）；另外根據(jù)林蔚等的研究發(fā)現(xiàn)AS 患者HLA-B27 陽(yáng)性率為85.7%，高于RA 患者（P<0.05）[4]，也說明了HLAB27 檢測(cè)可以作為鑒別相關(guān)疾病的一項(xiàng)重要指標(biāo)。AS 關(guān)節(jié)外表現(xiàn)可累及眼部、 腸道和腎臟等多系統(tǒng)[9]。本次研究有四例確診AS 患者來自眼科，并都是單眼并發(fā)葡萄膜炎（虹膜睫狀體炎），且均為男性。HLA-B27 陽(yáng)性與葡萄膜炎有著密切的關(guān)系已得到明確證實(shí)[10,11]。 由于AS 患者的眼部癥狀容易復(fù)發(fā)，且可導(dǎo)致患者致盲等嚴(yán)重后果,因此對(duì)于眼部疾病癥狀先于關(guān)節(jié)病變癥狀出現(xiàn)的患者, 在臨床診斷中，HLA-B27 應(yīng)作為一項(xiàng)排除強(qiáng)直性脊柱炎的篩查指標(biāo),以便早期發(fā)現(xiàn)強(qiáng)直性脊柱炎并針對(duì)性地對(duì)患者進(jìn)行治療，具有重大的臨床意義[12]。

流式細(xì)胞術(shù)法所用的單克隆抗體在檢測(cè)HLA-B27 時(shí)會(huì)與其它HLA 抗原 （特別是HLAB7）發(fā)生交叉反應(yīng)，對(duì)檢測(cè)結(jié)果造成影響。 目前，國(guó)內(nèi)常用的Beckman-Coulter 有商品化的HLA-B27-FITC/HLA-B7-PE 雙標(biāo)單克隆抗體試劑，本研究使用這種方法對(duì)HLA-B27/B7 進(jìn)行分析,同時(shí)分析熒光陽(yáng)性百分率和平均熒光強(qiáng)度,可以大幅度提高檢測(cè)靈敏度和特異性,減少HLA-B7 交叉反應(yīng)可能會(huì)引起的HLA-B27 假陽(yáng)性[1]。 同時(shí)FCM 抗原檢測(cè)方便快捷，操作簡(jiǎn)單，能夠快速檢測(cè)大量細(xì)胞,極大地節(jié)約了分析時(shí)間，是臨床篩查AS 的理想方法。 雖然也有研究采用PCR-SBT 分型方法對(duì)AS 患者及健康對(duì)照人群檢測(cè)HLA-B27 基因主要致病亞型及可能的保護(hù)亞型,對(duì)于癥狀體征不典型患者和疑難患者的診斷和鑒別診斷具有一定價(jià)值[13]，尤其是對(duì)處于臨界值抗原弱表達(dá)的判斷可提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 但PCR 方法對(duì)操作人員和實(shí)驗(yàn)條件的要求比較高,因此目前國(guó)際上普遍采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)人類白細(xì)胞抗原B27。

綜上所述, 用流式細(xì)胞術(shù)來檢測(cè)HLA-B27+/B 7-的表達(dá),其靈敏度和特異性具有較高的臨床適用性，結(jié)合臨床癥狀和影像學(xué)檢查，不僅可以提高診斷AS 的準(zhǔn)確性, 還可以作為早期診斷AS 和鑒別診斷的指標(biāo)，讓更多的患者得到早期診斷，盡早進(jìn)行預(yù)防或及時(shí)治療。 對(duì)于臨床高度疑似AS 而HLA-B27+/B7-檢測(cè)陰性的患者，應(yīng)加強(qiáng)長(zhǎng)期隨訪，以減少漏診和誤診。