P2X7 受體蛋白表達對胰腺癌的發生及發展的影響

尚偉偉，司華，李金旭，王紅雷，孫慶章

（南陽市第二人民醫院1.肝膽外科；2.護理部，河南 南陽473000）

流行病學研究顯示,胰腺癌的發病率可達223~455/10 萬人左右[1]。 在合并有消化系統疾病特別是膽道系統疾病的人群中,胰腺癌的發病率可進一步上升。 現階段臨床上對于胰腺癌的病因研究顯示，細胞生物學因子的改變或者基因轉錄、蛋白表達調控水平等的改變，能夠影響癌細胞浸潤能力、侵襲能力，提升癌細胞的擴散風險，進而促進惡性腫瘤的早期發生及臨床預后的惡化。 P2X7 受體是重要的嘌呤類受體家族成員,其表達濃度的上升能夠通過誘導癌細胞腫瘤信號通路的激活,促進癌細胞細胞周期調控的異常,增加胰腺導管上皮細胞分化障礙、DNA 異常擴增等風險的提升[2,3]。 部分研究揭示了P2X7 受體在胰腺惡性腫瘤中的異常表達情況,發現高表達的P2X7 受體與胰腺癌的發生密切相關[4]，但缺乏對于P2X7 受體與患者臨床分期、組織學分型等臨床病理特征的關系研究。 為了進一步揭示P2X7 受體的表達與胰腺癌臨床病理特征的關系,從而為臨床上胰腺癌的預后評估提供可靠的參考指標,本次研究選取本院病理科收集的手術后胰腺癌組織80 例,探討了P2X7 受體蛋白的表達及其與患者臨床病理特征的關系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院病理科收集的手術后胰腺癌組織80 例為病例組、 既往病理科收集的20例正常胰腺組織石蠟塊為對照組, 收集時間2013年1 月-2017 年1 月。

病例組，男47 例、女33 例，年齡38～75 歲，平均59.6±13.0 歲,病灶部位：胰腺頭部66 例,胰腺體尾部14 例;腫瘤病灶直徑≥4cm 44 例,<4cm 36 例;UICC 分期標準：Ⅰ期18 例、Ⅱ期26 例、Ⅲ期36例；分化程度：高分化17 例、中分化21 例、低分化42 例。對照組，男12 例、女8 例，年齡27～75 歲，平均56.0±14.1 歲；隨訪12 個月死亡59 例，存活21例。 兩組患者的年齡、性別比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴患者年齡19～75 歲; ⑵對照組標本來源于既往外傷患者手術切除標本,經手術后病理檢查均為正常胰腺組織;⑶胰腺癌患者在手術前未接受放化療；⑷胰腺癌患者術前經CT、MRI 檢測診斷，術后經病理學檢查證實；⑸兩組研究對象的基礎資料均完整。

1.2.2 排除標準 ⑴轉移性胰腺癌； ⑵未經病理學檢查證實的胰腺組織；⑶資料不完整，難以納入統計分析。

1.3 免疫組化檢測方法 所有組織標本經石蠟包埋后作連續切片，厚度約為4mm，采用免疫組化鏈霉卵白素一生物素復合體法 (strep avidin—biotin complex，SABC 法) 染色，二氨基聯苯胺(diamionben zidene，DAB)顯色。P2X7 受體蛋白抗體、PV6000 通用型二抗以及SP 試劑盒和DAB 顯色盒均購自北京中杉金橋生物技術開發公司。 以陽性片及PBS代替一抗分別作為陽性及陰性對照,高倍顯微鏡下觀察相關蛋白的表達情況,具體染色步驟嚴格按照SP 試劑盒說明書進行操作。

1.4 免疫組化結果判斷標準 免疫組化結果判定：P2X7 受體蛋白的陽性著色表達于細胞膜和細胞質，呈黃色、棕黃色、褐色表達，⑴根據著色強度：0分為無色、1 分為淡黃色、2 分為棕黃色、3 分為褐色、黑色；⑵根據陽性細胞比例：陽性細胞數目所占比例≤10%為1 分、陽性細胞所占比例11%～50%為2 分、陽性細胞數51%～75%為3 分、陽性細胞數所占比例>75%為4 分，兩種積分相乘總分<3 分為陰性、≧3 分為陽性。總分<3 分：“-”表達；為3～5分，“+”表達；為6～9 分，“++”表達；>9 分，“+++”表達。

1.5 統計學方法 統計軟件采用SPSS16.0，采用均數±標準差（x±s）進行統計描述，組間比較采用t 檢驗；計數資料采用百分比（%）表示，組間比較采用χ2檢驗； 多因素分析采用Logistic 回歸分析法；P<0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組胰腺組織標本中的P2X7 受體蛋白陽性表達率比較 病例組胰腺癌組織中的P2X7 受體蛋白陽性表達率66.25%顯著的高于對照組胰腺組織中的10.00%，差異具有統計學意義（P<0.05）,見表1，圖1。

表1 兩組胰腺組織標本中的P2X7 受體蛋白陽性表達率比較

2.2 P2X7 受體蛋白陽性表達與胰腺癌臨床病理特征的關系 UICC 分期（Ⅲ期）胰腺癌組織的P2X7受體蛋白陽性表達率、低分化程度的P2X7 受體蛋白陽性表達率、發生淋巴結轉移的P2X7 受體蛋白陽性表達率均分別顯著的高于UICC 分期（Ⅰ期+Ⅱ期）、高+中分化、未發生淋巴結轉移的胰腺癌組織，差異具有統計學意義（P<0.05）；胰腺癌組織的P2X7 受體蛋白陽性表達率表達與患者的年齡、性別、病灶部位、病灶直徑無關（P>0.05）,見表2。

圖1 A 為胰腺癌組織中P2X7 受體蛋白陽性表達，B 為正常胰腺組織中P2X7 受體蛋白陰性表達（SP×200 倍）

表2 P2X7 受體蛋白陽性表達與胰腺癌臨床病理特征的關系

2.3 P2X7 受體蛋白表達與胰腺癌患者預后關系的多因素分析 經Logistic 回歸分析，UICC 分期為Ⅲ期、組織學低分化、P2X7 受體蛋白陽性表達是胰腺癌患者12 個月隨訪不良結局的獨立危險因素（P<0.05）,見表3。

3 討論

胰腺癌的發病病因較為復雜,一般認為基因水平或者激素水平的波動可能是促進胰腺癌發生的主要因素。 已經公認的激素的敏感性的改變，特別是胰腺上皮細胞膜上激素受體的上調,能夠顯著促進惡性腫瘤的發生。近年來,越來越多的研究顯示，基因調控或者分子生物學水平的改變,是促進胰腺癌發生的又一重要因素。 分子譜相關水平的波動，能夠影響癌細胞的生物學特征、增強癌細胞細胞周期的調控，促進免疫逃逸、抑制機體的T 淋巴細胞免疫反應等，進而協助腫瘤的浸潤或者轉移[5,6]。 本次研究對于P2X7 受體蛋白的表達分析研究，能夠為臨床上胰腺癌患者的術后隨訪、術前病情評估等提供潛在的參考指標。

表3 P2X7 受體蛋白表達與胰腺癌患者預后關系的多因素分析

P2X7 受體蛋白是重要的過氧化酶抗過氧化酶相關因子，能夠促進體內的氧化反應的激活，提高患者體內的炎癥反應,增加不同的細胞炎癥因子對于胰腺上皮細胞的浸潤，誘導低氧環境，增加癌細胞持續性DNA 分裂的風險。 P2X7 受體蛋白在甲狀腺癌、肝癌等惡性腫瘤病灶組織中存在一定程度的異常表達,其蛋白結構上包含的多個可結合的巰基結構,能夠促進患者體內的癌細胞膜表面的糖蛋白的激活, 增加癌細胞內的腫瘤相關信號通路如AKT 等的上調,增加癌細胞分化凋亡障礙[7,8]。另外，P2X7 受體對于嘌呤類受體或者含巰基類受體的激活作用，能夠促進癌細胞生物學特征、腫瘤病灶組織學特征等的變化，影響到腫瘤的病情進展[9]。

本次研究通過免疫組化分析研究發現,在胰腺癌病灶組織中P2X7 受體蛋白的表達濃度明顯上升，高于正常胰腺組織，差異具有統計學意義，提示P2X7 受體蛋白可能參與了胰腺癌的病情進展過程中，P2X7 受體蛋白的高表達能夠通過影響到癌細胞的分化、促進癌細胞增殖速度的改變、加劇癌細胞的細胞周期調控障礙等,進而導致患者臨床病情的進展、臨床預后的惡化[10-12]：⑴P2X7 受體蛋白對于胰腺導管上皮細胞內NOTCH 蛋白的上調作用，能夠促進癌細胞粘附能力的下降，促進癌細胞的轉移； ⑵P2X7 受體蛋白對于癌細胞免疫逃逸的促進作用, 能夠導致癌細胞逃脫CD4+T 淋巴細胞的殺傷作用。Giannuzzo A 等[13,14]研究者在探討了部分胰腺癌患者的臨床病理特征后發現，P2X7 受體蛋白的平均陽性表達率可上升25%以上， 而患者的治療敏感性越差、 治療后的臨床轉歸越差，P2X7 受體蛋白表達陽性率上升越為明顯。 免疫組化染色分析可見，P2X7 受體蛋白主要定位于胰腺上皮細胞質內及細胞間質成分中,特別是在細胞核周邊的富集分為明顯，提示P2X7 受體蛋白可能作用通過影響到細胞內信號通路的調控異常,進而促進胰腺癌的發生。 在不同的腫瘤病灶直徑或者胰腺不同部位的腫瘤中，P2X7 受體蛋白的表達并無顯著的差異，而在發生了淋巴結轉移、臨床分期較晚或者細胞分化程度較差的人群中，P2X7 受體蛋白的表達陽性率較高，一方面提示P2X7 受體蛋白與胰腺癌患者的臨床病理特征密切相關,另一方面考慮P2X7 受體蛋白主要可能影響到癌細胞對于淋巴結內皮粘附因子adherin 1 的表達, 促進癌細胞對于臨近正常胰腺組織的浸潤,促進臨床分期等的進展。但部分研究者并未發現P2X7 受體蛋白的表達與患者淋巴結轉移的關系[15],考慮樣本量收集、檢測方法或者放化療的應用影響到了P2X7 受體的表達陽性率。 危險因素分析可見，UICC 分期為Ⅲ期、 組織學低分化、P2X7 受體蛋白陽性表達，是胰腺癌患者12 個月隨訪不良結局的獨立危險因素，進一步提示了P2X7 受體蛋白對于胰腺癌患者臨床結局的影響。

綜上所述，腺癌癌組織中P2X7 受體蛋白表達上調，并且與UICC 分期、腫瘤分化及發生淋巴結轉移密切相關。