紫花苜蓿內生解淀粉芽孢桿菌Ba09的分離及防效研究

李健，高興祥，李美，房鋒

（山東省農業科學院植物保護研究所，山東濟南 250100）

紫花苜蓿（Medicago sativa）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，是我國種植面積最大的牧草，同時也是世界范圍內種植時間最久的重要牧草之一［1，2］。在長期種植過程中，紫花苜蓿病害呈現出多樣性和危害性增強的趨勢，如根腐病和褐斑病等病害對紫花苜蓿產量造成嚴重影響。世界范圍內，每年由病害導致苜蓿產量損失在20%以上［3］。目前苜蓿病害防控主要使用化學殺菌劑，雖對降低病害、苜蓿產量起到重要作用，但長期使用，不僅導致病菌產生抗藥性，而且對苜蓿品質、安全、環境健康產生威脅［3-5］。因此，對于環境友好型微生物生防資源的需求越來越迫切。

植物內生菌是指一類存在于植物體組織內，但是并不引起生物病害的一類微生物的總稱［6］。研究顯示，植物內生菌功能復雜，部分內生菌對植物的正常生長發育起到一定的保護作用，在植物抵御病害過程中扮演重要角色［7，8］。植物內生菌類群多樣，主要包括真菌、細菌和放線菌等，其中芽孢桿菌屬（Bacillus spp.）是目前研究及應用較多的一類生防細菌。該類細菌在生長過程中往往能夠通過代謝產物達到抑制植物病原菌生長的目的［9，10］。本研究從苜蓿中分離得到一株內生細菌Ba09，并對其進行分類鑒定和抑菌效果分析，為下一步開展苜蓿病害生物防治積累微生物菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株與樣品采集 樣品采集于山東省農業工程學院齊河院區苜蓿試驗園，由山東省農業科學院植物保護研究所進行分離。

供試植物病原菌菌株：炭疽菌（Colletotrichum acutatum）、鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、鏈格孢菌（Alternaria alternata），均保存于山東省農業科學院植物保護研究所。

1.1.2 培養基 馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA）：馬鈴薯 200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g。

營養瓊脂培養基（NA）：蛋白胨10 g，牛肉粉3 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花苜蓿內生菌的分離 紫花苜蓿葉片用清水反復沖洗干凈、晾干；超凈工作臺內，75%乙醇浸泡1 min，無菌水沖洗3遍，5%次氯酸鈉表面消毒3 min，無菌水沖洗3遍，晾干。將表面消毒后的葉片置于NA培養基平板上，光照培養箱內培養48 h后進行觀察，并將產生的菌落轉移到新的NA培養基中。對照用組織印記法檢測表面消毒效果。

1.2.2 生防效果測定 采用對峙培養法［11］測定菌株對待測病原菌的拮抗作用。對峙培養7 d后，采用十字交叉法測量對照的菌落直徑（mm）和對峙培養菌落直徑（mm）并計算抑制率。抑制率（%）＝（對照菌落直徑-對峙培養菌落直徑）／對照菌落直徑×100。顯微鏡下觀察對峙培養病原菌邊緣菌絲狀態。

1.2.3 菌株的鑒定 NA培養基活化 Ba09菌株，28℃恒溫培養5 d，觀察菌落形態、顏色、凸起特征、邊緣狀態等。用TaKaRa細菌基因組提取試劑盒（TaKaRa MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit）提取基因組 DNA，采用通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和F1541（5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′）擴增16S rRNA序列。擴增體系（25μL）：10×Buffer 2.5μL，dNTP 1μL，引物各 1μL，Taq酶0.5μL，模板DNA 1μL，ddH2O 18μL。PCR反應程序：94℃ 4 min；94℃ 30 s，56℃ 45 s，72℃ 1.5 min，30個循環；72℃ 10 min?；厥?PCR產物，由生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。

測序結果在NCBI進行BLAST比對，選取相似序列，采用MEGA 6.0和ClustalW進行系統進化分析。

2 結果與分析

2.1 菌株的鑒定

經NA培養基培養發現，該菌株菌落不規則，整體近圓形，菌落邊緣不整齊，上生皺褶，無光澤。擴增獲得長度為1 469 bp的16S rRNA序列。BLAST序列比對發現，Ba09菌株的16S rRNA序列與解淀粉芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和貝萊斯芽孢桿菌等芽孢桿菌屬序列同源性在99%以上。系統發育樹結果（圖1）顯示，Ba09菌株與解淀粉芽孢桿菌親緣關系更近，結合形態學觀察，將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）。

圖1 菌株Ba09系統發育樹分析

2.2 Ba09菌株的生防效果

2.2.1 抑菌效果 對峙培養試驗結果表明，Ba09菌株對待測病原菌均表現出不同程度的拮抗性（圖2），抑制率在43.11% ～77.19%之間，其中對炭疽菌抑制效果最好，對鐮刀菌抑制效果相對較差（表1）。

表1 Ba09對供試病原菌的抑制率

圖2 菌株Ba09對供試病原菌的抑制效果

2.2.2 病原菌顯微觀察 顯微觀察顯示，Ba09菌株對待測病原菌均表現出不同程度的拮抗性，在未發生菌落直接接觸的情況下，供試病原菌的菌絲生長受抑制并出現扭曲、頂端呈球狀膨大等現象（圖3）。

圖3 菌株Ba09抑菌顯微觀察

3 討論與結論

目前主要通過使用化學藥劑開展植物病害防控，不僅容易造成高抗性病原菌的產生，而且對生態環境也會造成污染。近年來，基于農業健康可持續發展的需求，通過代謝物抑菌或通過誘導系統抗性防治植物病害的環境安全型生物菌劑得到越來越多的重視。芽孢桿菌屬細菌在自然界廣泛存在，其生長迅速，產生的芽孢抗逆能力強，能夠在多種環境下應用。研究發現，芽孢桿菌屬細菌生長過程中均能產生對多種植物病原菌具有廣泛抑制作用的物質［12］，芽孢桿菌及其代謝產物不但可以直接抑制病原菌的生長，而且能誘導寄主植物產生系統抗病效應［13］。荊卓瓊等［10］研究發現，解淀粉芽孢桿菌HZ-6-3對番茄灰霉病的防控效果較好。胡進玲等［14］分離得到的解淀粉芽孢桿菌對苜蓿的多種病原菌均表現出良好的拮抗作用。

對峙培養過程中Ba09菌株未與待測病原菌菌絲體直接接觸，但病原菌均受到不同程度的抑制，菌絲形態發生改變等，說明Ba09菌株是通過分泌抗生素物質或有毒代謝產物作用于病原菌，從而起到抑菌作用。Basha等［15］研究發現，芽孢桿菌抑菌過程可能與拮抗菌分泌的抗菌肽類或蛋白類物質有關，其中幾丁質酶具有溶解植物病原菌細胞壁的能力，可能是芽孢桿菌拮抗病原菌的重要物質之一［16］。

本研究篩選得到一株紫花苜蓿內生菌，并鑒定為解淀粉芽孢桿菌。對峙試驗和顯微觀察顯示，其對多種植物病原菌均表現出良好的拮抗效果，具有一定的生防應用潛力，下一步將重點關注該菌株的抑菌機理及田間應用效果。