芍藥舒筋片通過miRNA-140對骨關節炎大鼠軟骨細胞中Wnt/β-catenin信號通路的調控作用*

徐海濤，高寧陽，顧新豐，張 琥，杜 炯，談繹文，王學宗，鄭昱新

上海中醫藥大學附屬曙光醫院骨關節科(上海 201203)

骨關節炎(Osteoarthritis，OA)是一種慢性退行性病變，多發生于中老年人群。在中醫理論中，OA被歸納于“骨痹”“骨痿”范疇，其發病機制為氣血不足，肝腎虧虛。人到中年，人體肝腎功能下降，供血不足，容易導致筋骨失養，濕寒侵入機體后容易造成筋脈痹阻不通[1-2]。還可由激素紊亂、肥胖、關節過度勞損和外力損傷等因素引發關節軟骨退化和骨質增生，嚴重影響患者的正常運動功能及其生活質量[3-4]。因此，如何延緩及修復OA患者的關節軟骨退化和骨質增生是目前骨關節病臨床上的一大熱點問題。Wnt/β-catenin信號通路是一個可參與調節細胞增殖和凋亡等多種生物進程的信號轉導途徑[5]。微小核糖核酸(Micro ribonucleic acid，miRNA)能夠識別目標miRNA的3’非編碼區的結合位點進行堿基配對，實現基因在轉錄后表達的負調控，從而能夠參與大多數真核生物的細胞凋亡、增殖等功能[6-7]。miRNA-140作為miRNA家族中的一員，其在斑馬魚等動物中具有高度軟骨特異性[8]。芍藥舒筋片具有補益肝腎、散寒除濕、活血化瘀的功效，可用于治療OA早中期肝腎虧損，血瘀經阻等癥狀的患者[9]。本研究通過構建OA大鼠模型，研究芍藥舒筋片通過miRNA-140對Wnt/β-catenin信號通路的調控作用，從而探討芍藥舒筋片對OA大鼠軟骨細胞的保護作用機制。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：取SD大鼠45只，體質量(192.16±10.21)g。購于上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK(滬)2008-0016。復合飼料喂養，飼養溫度為20 ℃～25 ℃，濕度為60%。將45只SD大鼠隨機分為假手術組(15%正常大鼠血清+F12培養基)、OA對照組(15%正常大鼠血清+F12培養基+IL-1β)、OA治療組(15%芍藥舒筋片含藥血清+F12培養基+IL-1β)，每組各15只。

1.2 實驗藥物：芍藥舒筋片(真空干燥粉)，由上海中醫大源創科技有限公司提供，批號：20110616。主要成分：白芍、秦艽、牡蠣、全蝎、蜈蚣、甘草。劑型：片劑；規格：0.35 g/片。

2 實驗方法

2.1 骨關節炎軟骨細胞造模方法：OA對照組和OA治療組采用改良Hulth造模法[10]，即將大鼠麻醉固定于手術臺上，無菌條件下去膝關節內側縱切口長約2 cm，顯露膝關節，切斷大鼠膝關節前交叉韌帶、內側副韌帶并縫合，保留關節軟骨面。假手術組暴露關節腔而不切斷前交叉韌帶和內側副韌帶。三組均繼續飼養，任其自由活動，可適當給予抗生素預防感染。假手術組和OA對照組在建模2周后開始灌胃生理鹽水，OA治療組則灌胃等量芍藥舒筋片，1次/d，給藥持續4周。

2.2 觀察指標:培養4周后，連續8 d采用CCK-8溶液檢測藥物對細胞增殖的影響，用酶聯免疫檢測儀在波長450 nm處測量各孔的吸光值(OD)。軟骨組織學評分采用Mankin[11]評分。

培養4周后，采用實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qTR-PCR)檢測各組軟骨細胞miRNA-140表達；采用qTR-PCR檢測各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達：參照文獻[12]，引物設計：Wnt-3a上游引物：5’-AGACTATCTCTGTCATG-3’，下游引物：5’-GCCCCGTATAGGCATTCGA-3’；β-catenin上游引物：5’-ACCATTCGGCTAAACGGTC-3’，下游引物：5’-CAGGCCATTTACGATTACA-3’；GSK-3β上游引物：5’-GCTATGAATTCGATCGAGT-3’，下游引物：5’-CAGGGCTTAGGCAGTGAA-3’。PCR擴增條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，60℃復性30 s，73 ℃延伸50 s，共循環32次，72 ℃、10 min。培養4周后，采用免疫印跡法(Western blot)[13]檢測各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表達。抽取細胞總蛋白，采用BCA方法鑒定蛋白濃度。

結 果

1 各組軟骨細胞增殖比較 OA對照組中軟骨細胞的增殖速率明顯低于假手術組，相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。OA治療組中軟骨細胞的增值速率明顯高于OA對照組，相比較差異具有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組軟骨細胞增殖的OD值比較

2 各組關節軟骨組織學評分及miRNA-140的表達比較 OA對照組中Mankin評分明顯高于假手術組，miRNA-140相對表達量明顯低于假手術組，且差異均具有意義(P<0.05)。OA治療組中Mankin評分明顯低于OA對照組，miRNA-140相對表達量明顯高于OA對照組，相比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組關節軟骨組織學評分及miRNA-140的表達比較

3 各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達比較 OA對照組和OA治療組中細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達水平明顯高于假手術組，相比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。OA治療組中細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達水平明顯低于OA對照組，相比較差異均具有意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β miRNA表達比較

4 各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β蛋白表達比較 見表4(圖1)。OA對照組和OA治療組中細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達水平明顯高于假手術組，相比較差異均具有統計學意義(P<0.05)。OA治療組中細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達水平明顯低于OA對照組，相比較差異均具有意義(P<0.05)。

表4 各組軟骨細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 蛋白表達比較

注：GAPDH是蛋白質表達檢測內參

討 論

OA是一種退行性慢性關節疾病，在我國傳統醫學中屬于“痹癥”“骨痹”范疇。《素問·氣穴論》：“積寒留舍，榮衛不居，卷肉縮筋，肋肘不得伸，內為骨痹”指出骨痹與年老體衰、外感風寒濕有關。年老肝腎虧損，經骨失養，血瘀氣滯，風寒濕邪，經絡受阻[14]。因此，目前主要以補益肝腎、活血化瘀的藥物治療OA[15]。芍藥舒筋片主要由白芍、秦艽、牡蠣、全蝎、蜈蚣、甘草等構成[16]。白芍養血柔肝，調經止痛；秦艽祛濕止痹，清熱止痛；牡蠣滋陰壯陽；全蝎、蜈蚣通絡攻毒，鎮痙散結；甘草清熱解毒，諸藥合用，補益肝腎、散寒除濕、活血化瘀，對OA患者早中期肝腎虧損，血瘀經阻等癥狀有較好的治療效果[17]。

本研究結果顯示，與假手術組相比，OA對照組IL-1β誘導退化的軟骨細胞增值速率明顯降低，而OA治療組中軟骨細胞增值速率又明顯高于OA對照組。說明芍藥舒筋片治療能夠促進退化軟骨細胞增殖。且研究結果顯示，OA對照組中Mankin評分明顯高于假手術組，OA治療組中Mankin評分明顯低于OA對照組。說明芍藥舒筋片治療后能夠有效降低Mankin評分，延緩骨關節炎大鼠的軟骨退變，對骨關節軟骨起到一定的保護作用。錢春美等[18]研究發現，芍藥舒筋片在高、中、低劑量下有較好的關節軟骨保護作用，可降低Mankin評分，一定程度延緩機械失穩造成的膝骨關節炎大鼠的軟骨退變，這與本研究結果部分一致。OA對照組中miRNA-140相對表達量明顯低于假手術組，OA治療組中miRNA-140相對表達量明顯高于OA對照組。分析其中原因之一為IL-1β能夠誘導軟骨細胞退化，且能夠抑制關節軟骨細胞中miRNA-140的表達，而芍藥舒筋片能夠調節IL-1β誘導的軟骨細胞退化程度。所以在經過IL-1β處理后的OA對照組中miRNA-140表達量明顯降低，服用芍藥舒筋片后的OA治療組miRNA-140表達量高于OA對照組[19-20]。

本研究結果顯示，OA對照組和OA治療組中細胞Wnt-3a、β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表達水平明顯高于假手術組，OA治療組中的細胞Wnt-3a、

β-catenin、GSK-3β 的miRNA和蛋白表達水平明顯低于OA對照組。說明芍藥舒筋片能夠降低Wnt/β-catenin信號通路活性，抑制其重要分子的miRNA和蛋白表達水平，從而延緩軟骨細胞的退變速率。分析其中原因之一為在軟骨細胞未分化時，Wnt-3a能夠明顯抑制miRNA-140的表達。因此，OA治療組中表達較高的miRNA-140能夠負調控Wnt-3a的表達水平，從而降低Wnt/β-catenin信號通路活性[21-22]。

綜上，芍藥舒筋片能夠增加OA大鼠軟骨細胞中miRNA-140的相對表達量和軟骨細胞的增殖速率，降低Mankin評分，且能夠通過調節Wnt/β-catenin信號通路活性，延緩軟骨退變的作用機制，從而發揮其對關節軟骨細胞的保護作用。