黃芪對肝纖維化大鼠肝損傷保護作用及機制研究*

雷 玲，閔 珺，劉 鋒，肖秀清，杜 凡

1.南昌大學第三附屬醫院(南昌 330008)；2.南昌市青山湖區食品藥品監督管理局(南昌 330029)；3.中山大學附屬第三醫院(廣州 510630)

肝纖維化(Hepatic fibrosis，HF)是肝臟應對慢性損傷的一種修復反應[1-2]。 也是慢性肝病向肝硬化發展的中間環節，是逆轉病情的一個關鍵階段[3]。近年的肝病領域諸多研究均在圍繞肝纖維化發生及逆轉機制為熱點展開，相對于現代醫學缺乏安全有效的治療手段，而中醫藥治療肝病有長期臨床實踐，為其在抗纖維化方面的研究提供了堅實的基礎，中醫藥多途徑、多靶點、多層次的特點在抗HF方面顯示出獨特的優勢。肝郁脾虛是慢性肝纖維化的常見類型，常與血瘀一起存在于整個慢性肝病過程中。軟肝健脾丸是以黃芪為主要成分之一的治療慢性乙型肝炎肝纖維化的常用藥物，軟肝健脾丸的臨床研究結果顯示，其能顯著改善慢性肝纖維化患者肝功能和臨床癥狀及肝纖維化血清學指標。黃芪具有抗HF作用，可部分逆轉模型動物中的肝纖維化[4]。 然而，HF的逆轉過程十分復雜，影響因素眾多，確切機制仍不甚明了。

MAPK激酶-3 (MAPK kinase 3，MKK3)是一組分布于胞漿中具有絲氨酸和酪氨酸雙重磷酸化能力的蛋白激酶，其通過連接細胞表面受體和細胞內關鍵調控因子參與基因表達，經雙重磷酸化激活后可參與細胞內多種生理過程，對細胞增殖、凋亡、癌變等方面都具有重要的意義。p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinases，p38MAPK)信號傳導通路是MAPK家族的重要成員，其在肝纖維化過程中的作用越來越受到關注[5-6]。p38MAPK的激活因子首先要激活上游的促分裂原活化蛋白激酶激酶激酶(Mitogen-activated protein kinase kinase kinase，MAPKKK)再激活MKK3/6，磷酸化蘇氨酸和絡氨酸殘基從而使p38MAPK活化[7]。活化的p38MAPK可作用于靶基因調控下游多種酶及轉錄因子的基因表達活性。轉錄激活因子-2 (Activating transcription factor 2，ATF-2)是p38MAPK通路的重要下游因子，其特定堿基被p-p38MAPK磷酸化后表現出明顯增加的結合和轉錄活性，激活下游底物從而誘發特定基因的表達，在肝纖維化過程中起重要作用能促進肝纖維化過程，因此抑制p38MAPK通路對治療肝纖維化有積極的作用[8-10]。

為探討黃芪對肝纖維化損傷大鼠的保護作用，本研究擬通過CCl4誘導大鼠肝纖維化，檢測p38MAPK信號通路相關上下游蛋白的表達情況，探討p38MAPK信號通路在黃芪后處理大鼠肝纖維化損傷中的作用，闡明肝纖維化的發病機制，為臨床上應用黃芪治療肝纖維化提供實驗依據。

材料與方法

1 實驗材料

1.1 實驗動物：清潔級SD大鼠，雄性，體質量170～230 g，購于南昌大學醫學院動科部,每3只一籠飼養于24 ℃恒溫恒濕環境中，自由攝取標準的大鼠專用飼料及無菌水。

1.2 主要試劑：CCl4(北京索萊寶公司)；黃芪分析標準品，經HPLC檢測質量分數>99.5% (源葉生物公司)；復方鱉甲軟肝片(福瑞醫療公司)；HE、Masson染色試劑盒(碧云天公司)；丙氨酸氨基轉移酶(Alanine aminotransferase，ALT)檢測試劑盒和天門冬氨酸氨基轉移酶(Aspartate aminotransferase，AST)檢測試劑盒(Sigma-aldrich公司)；總膽紅素(Total bilirubin，TBIL)Elisa試劑盒(上海奧陸)；大鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)、MKK3、p-p38MAPK(Cell Signal公司)；GAPDH、p-AFT-2一抗(Santa Cruz公司)；WB二抗(博士德公司)；核糖核酸(Ribonucleic acid，RNA)提取試劑盒(Gibco公司)；逆轉錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)試劑盒(寶生物公司)；根據GenBank序列設計引物，由上海生工生物有限公司合成引物。

1.3 主要儀器：Multiskan ascent酶標儀(Thermo scientific公司)；可見光成像系統(Olympus公司)；全自動生化分析儀(Beckman公司)；E-Gel imager凝膠成像儀(Invitrogen公司)；Mini-protean tetra system垂直電泳槽、轉膜儀、Minitrans-bolt小型濕轉印槽、ChemiDocTMXRS加凝膠成像系統、伯樂電泳轉印系統(Bio-Rad公司)。

2 實驗方法

2.1 動物模型的建立與處理：①實驗動物分組:將實驗動物隨機分為正常對照組、肝纖維化模型組、陽性對照組和三種不同劑量黃芪后處理組，每組各6只大鼠。②建立動物模型:第1～4周連續建模，肝纖維化模型組、陽性對照組和黃芪后處理組以6 ml/kg的劑量2次/周，皮下注射含20% CCl4的玉米油溶液建立肝纖維化損傷大鼠模型。正常對照組2次/周，皮下注射6 ml/kg的玉米油溶液。③藥物后處理第5～9周，藥物后處理：建模完成后，連續給藥5周。正常對照組和肝纖維化模型組大鼠每日用生理鹽水灌胃1次。陽性對照組大鼠每日用鱉甲軟肝以10 ml/kg的劑量灌胃1次。 黃芪后處理組大鼠每日用黃芪溶液灌胃1次，分為 0.1 mg/kg小劑量組、0.5 mg/kg常規劑量(0.5 mg/kg的藥量為臨床應用劑量)組和2.5 mg/kg大劑量組灌胃。所有實驗大鼠每周日稱量大鼠質量，然后根據大鼠體質量變化來調整下1周的藥物處理劑量。末次灌藥后，給予大鼠禁食24 h禁水12 h處理。

2.2 各組大鼠肝功能檢測：麻醉大鼠后腹主動脈取血，4000 r/min離心15 min分離收集血清，嚴格按照試劑盒說明書操作，檢測各組大鼠血清中ALT、AST、 TBIL水平。

2.3 RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟組織中5種主要致纖維化因子：p38MAPK、轉化生長因子-β1 (Transforming growth factor β1，TGF -β1)、α-平滑肌肌動蛋白(α smooth muscle actin，α-SMA)、結締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和Ⅳ型膠原蛋白信使核糖核酸(Collegen Ⅳ mRNA)表達變化。RNA提取：將保存于-80 ℃冰箱中的各組大鼠肝臟組織按照Trizol試劑盒操作步驟依次勻漿、離心、提純、定量。取3 μg總RNA進行逆轉錄，依次加入dd H2O 10 μl、RNA模板4 μl、5×逆轉錄buffer 4 μl、oligo(dT)0.5 μl、dNTPs 0.5 μl、逆轉錄酶1 μl，37 ℃孵育1 h，95 ℃孵育5 min。RT-PCR擴增:PCR引物設計如下：GADPH的上游引物為5’GTCGGTGTGAACGGATTTG-3’，下游引物為5’TCCCATTCTCAGCCTTGACA-3’；p38MAPK的上游引物為5’AGACGAATGGAAGAGCCTGA-3’，下游引物為5’GGGATGGACAGAACAGAAGC-3’；TGF-β1的上游引物為5’ATTCCTGGCGTTACCTTGG-3’，下游引物為5’AGCCCTGTATTCCGTCTCCT-3’；CTGF的上游引物為5’GATGCCAGGAGAAAGACAGG-3’，下游引物為5’ACCGAGTGGAGGACACACAC-3’；α-SMA的上游引物為5’AGGGAGTGATGGTTGGAATG-3’，下游引物為5’GGTGATGATGCCGTGTTCTA-3’；Collegen Ⅳ的上游引物為5’GGCTTTCCAGGGTTACAAGG-3’，下游引物為5’GAAGTCCAGGTTCTCCAGCA-3’。逆轉錄合成的DNA按照以下條件進行PCR擴增：94 ℃、5 min預變性，94 ℃、30 s變性，55 ℃～60 ℃、45 s退火，72 ℃、45 s延伸32個循環，72 ℃、7 min最終延伸。RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟組織中mRNA相對表達量用2-△Ct方法計算。選擇出治療大鼠肝纖維化效果最佳的黃芪濃度，并用于后續實驗。

2.4 HE和Masson染色法測定各組大鼠肝臟形態學變化：取各組大鼠肝臟組織肝大葉縱切(每只大鼠取位置大致相同的肝臟組織)1～2 mm厚，用4%中性甲醛溶液固定48 h，制作3 μm厚度的病理石蠟切片，嚴格按照HE和Masson染色試劑盒說明書操作進行染色。顯微鏡下觀察肝組織結構、肝細胞炎癥反應及膠原纖維的表達量變化。

2.5 Western Blot法檢測MAPK通路上下游蛋白表達水平：分別取正常對照組、肝纖維化模型組、陽性對照組和黃芪后處理組大鼠肝臟組織約100 mg，加入1 ml的RIPA蛋白裂解液裂解快速勻漿、裂解，離心力12000 g、離心速度5978 rpm，離心2 min后取上清(蛋白)分裝于0.5 ml離心管中，加入loading后置于75 ℃水浴10 min使蛋白變性，BCA法測定蛋白濃度。取每組總蛋白5 μg進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉移到PVDF膜上。加入一抗后4 ℃孵育過夜，TBST清洗4次，5 min/次，加入與HRP偶聯的二抗室溫孵育1 h，TBST清洗次后ECL化學發光底物顯色，放射自顯影保存圖片。按照以上步驟，分別檢測GAPDH、p38MAPK、MKK3、p-AFT-2的表達水平， 定量分析結果以p38MAPK、MKK3、p-AFT-2與GAPDH內參蛋白的相對表達量比值表示。成像結果采用Quality One V 4.6軟件進行半定量分析處理，重復3次實驗。

結 果

1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL比較 陽性對照組大鼠為肝纖維化損傷大鼠模型建立后給予鱉甲軟肝進行灌胃治療，鱉甲軟肝目前為臨床上治療肝纖維化的藥物。陽性對照組與正常對照組相比，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平顯著升高，證明陽性對照組造模成功，且陽性對照組與肝纖維化組相比，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平顯著降低，證明鱉甲軟肝治療效果有效。當黃芪濃度為0.5 mg/kg 劑量處理時，大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平與陽性對照組水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)，證明在黃芪濃度為0.5 mg/kg時，其治療效果與鱉甲軟肝相同。與肝纖維化模型組相比，0.1 mg/kg黃芪后處理組與肝纖維化模型組相比，差異無統計學意義(P>0.05)。0.5 mg/kg劑量的黃芪后處理組大鼠血清中AST、ALT的活性和TBIL的水平降低，與肝纖維化模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05),說明0.5 mg/kg高劑量的黃芪對大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護作用。將黃芪濃度增大到2.5 mg/kg劑量時，大鼠血清中AST、ALT的活性和TBIL的水平與0.5 mg/kg劑量的黃芪組持平，說明2.5 mg/kg高劑量的黃芪對大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護作用且對大鼠肝臟組織無明顯藥物毒性損傷。見表1。

表1 各組大鼠血清中AST、ALT活性和TBIL水平比較

2 RT-PCR法檢測各組大鼠肝臟組織中主要致纖維化因子mRNA表達水平 與正常對照組相比，肝纖維化模型組、陽性對照組、黃芪后處理組中p38MAPK、TGF-β1、α-SMA、CTGF和Collegen Ⅳ mRNA表達水平均升高(P<0.05)，說明大鼠肝纖維化損傷。與肝纖維化模型組相比，0.1 mg/kg黃芪后處理組與肝纖維化模型組相比無統計學差異(P>0.05)，0.5 mg/kg黃芪后處理組中5種mRNA表達水平均降低，與肝纖維化模型組比較，差異具有統計學意義(P<0.05)，說明0.5 mg/kg劑量的黃芪對大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護作用。將黃芪濃度增大到2.5 mg/kg劑量時，大鼠血清中纖維化因子mRNA表達水平與0.5 mg/kg劑量的黃芪組持平，說明2.5 mg/kg高劑量的黃芪對大鼠肝纖維化損傷有顯著的保護作用且對大鼠肝臟組織無明顯藥物毒性損傷。見表2。

表2 各組大鼠肝臟中主要致纖維化因子mRNA表達水平比較

3 HE和Masson染色法測定各組大鼠肝臟形態學變化 正常對照組大鼠肝組織結構完整，細胞形態排列規則，中央靜脈區只有少量膠原纖維沉積，無炎性浸潤。而肝纖維化模型組大鼠肝組織結構破壞嚴重，肝細胞排列紊亂，正常結構消失，可見廣泛浸潤的炎性細胞，中央靜脈周圍及匯管區纖維沉積形成間隔，肝小葉和肝細胞索結構破壞。與肝纖維化模型組相比，0.5 mg/kg黃芪后處理組大鼠肝組織結構破壞不明顯，肝細胞形態排列較規則，肝組織炎性浸潤不明顯，且少見膠原纖維沉積，大鼠肝組織結構損傷程度及炎性細胞浸潤情況較陽性對照組更輕(圖1、2)。

注：圖中箭頭所示位置為炎性浸潤，結構破壞

注：圖中箭頭所示位置為膠原纖維沉積

4 Western blotting法檢測各組大鼠肝臟組織中蛋白表達變化 由表3(圖3)可知，與正常對照組相比，肝纖維化模型組、陽性對照組、0.5 mg/kg黃芪后處理組中p-p38MAPK、MKK3、p-AFT-2蛋白表達量均升高(P<0.05)；與肝纖維化模型組相比，0.5 mg/kg黃芪后處理組中p-p38MAPK、MKK3、p-AFT-2蛋白表達量均降低(P<0.05)，且與陽性對照組比較，無統計學差異(P>0.05)。

表3 各組大鼠肝臟組織中蛋白相對表達水平比較

A:正常對照組;B:肝纖維化模型組;C:陽性對照組;

討 論

肝纖維化作為大多數慢性肝病共有的病理特征，其表現為肝內結締組織增生與降解不平衡導致的沉積，是肝臟對各種原因所致肝損傷的創傷愈合反應[11]。近年來中藥在肝纖維化治療中的療效得到證實[12]。越來越多的研究表明，成功的抗纖維化治療能夠阻止或逆轉肝纖維化[13-14]。本研究進一步探討了黃芪通過“化瘀通絡”的作用干預肝纖維化“瘀血阻絡”效果研究，深化對中醫絡病理論的認識。本研究采用CCl4皮下注射法誘導建立肝纖維化動物模型，觀察黃芪對實驗性肝纖維化大鼠肝損傷的保護作用，并探討其作用機制。p38MAPK是MAPK家族中最主要、研究最深入的成員之一，在機體應激和炎癥反應調控中發揮極其重要的作用。它可因生理性應激、脂多糖、滲透性應激和紫外線照射等而激活，在發育和疾病發生過程中起重要作用。MKK3是p38MAPK上游激活物，p38MAPK被磷酸化激活后轉移到核內，與細胞內相應的物質結合，可激活下游底物從而誘發特定基因的表達，在肝纖維化過程中起重要作用。AFT-2是p38MAPK的主要作用底物。p38MAPK可通過激活調節包括TGF -β1、α-SMA等多種炎癥因子的基因表達。活化AFT-2有助于調節相關細胞生長、分化、免疫應答、應激反應、致癌性轉化、凋亡的基因轉錄[15]。

本研究發現，黃芪能顯著降低實驗性肝纖維化大鼠肝臟功能和結構損傷，對實驗性肝纖維化大鼠肝損傷具有有效保護作用。黃芪能顯著降低肝纖維化大鼠肝臟中p38MAPK的上游激活因子MKK3、磷酸化p38MAPK和p38MAPK的下游轉錄因子AFT-2的表達。因此我們推測，黃芪可以調控肝纖維化大鼠肝臟中p38MAPK信號傳導通路上下游相關蛋白的表達，抑制致纖維化因子的表達，抑制肝纖維化的形成。